本文關(guān)鍵詞：賴氨酸特異性去甲基化酶1參與卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的研究

  更多相關(guān)文章： LSD1 基因分子克隆 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 順鉑敏感性

【摘要】：目的初步研究傳統(tǒng)化療藥物順鉑對(duì)上皮源性卵巢癌細(xì)胞SKOV3中組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(Lysine Specific Demethylase 1,LSD1)蛋白表達(dá)量的調(diào)節(jié)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)功能學(xué)的影響;運(yùn)用基因分子克隆技術(shù)構(gòu)建LSD1干擾及過(guò)表達(dá)的卵巢癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,分別從細(xì)胞增殖、遷移和凋亡三方面探討靶向調(diào)控LSD1基因表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性中的作用。方法(1)觀察在濃度梯度的順鉑處理下卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的形態(tài)功能學(xué)變化,采用Western blot法檢測(cè)不同濃度順鉑影響下三大功能學(xué)相關(guān)指標(biāo)蛋白水平的改變和LSD1及其特異性反應(yīng)底物組蛋白H3K4甲基化蛋白表達(dá)量的變化情況,并篩選出順鉑作用的最佳濃度,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(2)擴(kuò)增、抽提LSD1干擾和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定所提各質(zhì)粒的純度和驗(yàn)證堿基量的大小。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行慢病毒包裝,獲得兩種高滴度的LSD1干擾和過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒,分別感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默LSD1表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、經(jīng)嘌呤霉素和遺傳霉素G418篩選獲得LSD1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,選擇多西環(huán)素最適工作濃度并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中目的基因序列的表達(dá),運(yùn)用Western blot法鑒定兩種SKOV3體外穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型是否成功構(gòu)建。(3)將LSD1干擾和過(guò)表達(dá)的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型作為研究對(duì)象,按多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)/不誘導(dǎo)、順鉑(Cisplatin)處理/不處理分為四組,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和Ed U試劑盒檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力的變化、Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力的改變、Annexin V/PI雙標(biāo)法細(xì)胞染色并經(jīng)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。此外,進(jìn)一步通過(guò)Western blot法從分子水平檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化情況,從而探究靶向調(diào)控LSD1基因表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性中的作用。結(jié)果(1)從形態(tài)功能學(xué)和蛋白表達(dá)水平分析,在順鉑作用下卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移能力明顯減弱、細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加;腫瘤細(xì)胞中LSD1相對(duì)表達(dá)量以順鉑濃度依賴的方式降低,其特異性反應(yīng)底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸升高,而H3K4me3無(wú)明顯變化趨勢(shì)。(2)實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的慢病毒介導(dǎo)干擾LSD1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)后LSD1相對(duì)表達(dá)水平降低,而過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞株經(jīng)誘導(dǎo)后可見(jiàn)LSD1的相對(duì)表達(dá)水平升高,表明成功干預(yù)LSD1基因在卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)。(3)慢病毒沉默LSD1表達(dá)的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中,干擾LSD1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖、遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而LSD1過(guò)表達(dá)細(xì)胞株則與之相反,可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移,抑制細(xì)胞的程序性死亡。此外,沉默LSD1的表達(dá)可以促進(jìn)順鉑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,增加順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移抑制率;而LSD1的過(guò)表達(dá)則增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗作用。結(jié)論本研究證實(shí)順鉑能夠調(diào)節(jié)SKOV3細(xì)胞中LSD1及其甲基化底物H3K4me1、H3K4me2的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖、遷移能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;成功構(gòu)建靶向干擾和過(guò)表達(dá)LSD1的兩種卵巢癌SKOV3體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型,分別能有效沉默和過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞中的靶基因LSD1;靶向干擾LSD1的表達(dá)能協(xié)同增加順鉑抑制細(xì)胞增殖、遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,能增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力;而LSD1過(guò)表達(dá)能拮抗順鉑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力,降低順鉑對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制率,增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受和抵抗。以上的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)為L(zhǎng)SD1的原癌基因性質(zhì)提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：LSD1 基因分子克隆 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 順鉑敏感性
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 緒論13-22
• 1.1 卵巢癌的現(xiàn)狀13-14
• 1.1.1 卵巢癌13
• 1.1.2 卵巢癌的治療13-14
• 1.2 表觀遺傳學(xué)14-15
• 1.2.1 表觀遺傳學(xué)的介紹14-15
• 1.2.2 腫瘤表觀遺傳治療15
• 1.3 LSD1的研究進(jìn)展15-17
• 1.4 基因靶向治療17-20
• 1.4.1 基因克隆技術(shù)17-18
• 1.4.2 慢病毒載體p LKO Tet puro18-19
• 1.4.3 慢病毒載體p LVX-IRES-puro19-20
• 1.5 研究方案及技術(shù)路線20-22
• 1.5.1 研究方案20
• 1.5.2 技術(shù)路線20-22
• 第二章 順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞功能學(xué)以及LSD1水平的影響22-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-27
• 2.1.1 主要儀器22-23
• 2.1.2 主要試劑23-25
• 2.1.3 主要溶液25-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-32
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)27
• 2.2.2 藥物處理27
• 2.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）27-29
• 2.2.4 MTT和Ed U試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力29-31
• 2.2.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力31
• 2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平31-32
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-37
• 2.3.1 順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞中LSD1表達(dá)的調(diào)節(jié)32-33
• 2.3.2 順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖功能的影響33-35
• 2.3.3 順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響35-36
• 2.3.4 順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡水平的影響36-37
• 2.4 討論37-40
• 第三章 靶向調(diào)控LSD1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建40-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40-43
• 3.1.1 主要儀器40-41
• 3.1.2 主要試劑41-42
• 3.1.3 主要溶液42-43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 3.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與抽提43-44
• 3.2.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染44-45
• 3.2.4 病毒上清液感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選45
• 3.2.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定45
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法45-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 3.3.1 質(zhì)粒檢測(cè)及轉(zhuǎn)染情況46-47
• 3.3.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定結(jié)果47-49
• 3.4 討論49-50
• 第四章 靶向調(diào)控LSD1影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性50-62
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 4.1.1 主要儀器50
• 4.1.2 主要試劑50-51
• 4.1.3 主要溶液51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)51
• 4.2.2 藥物處理51-52
• 4.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）52
• 4.2.4 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)52
• 4.2.5 細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)52-53
• 4.2.6 細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)53
• 4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-59
• 4.3.1 檢測(cè)LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細(xì)胞增殖的變化53-55
• 4.3.2 檢測(cè)LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細(xì)胞遷移的變化55-57
• 4.3.3 檢測(cè)LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細(xì)胞凋亡的變化57-59
• 4.4 討論59-62
• 第五章 主要結(jié)論與展望62-63
• 5.1 主要結(jié)論62
• 5.2 展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-74
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文74-75
• 致謝75

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉爽;林靜嫻;劉琦;石群立;王建東;吳元赭;;維A酸干預(yù)前后卵巢癌細(xì)胞中維A酸受體的表達(dá)變化及意義[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2007年11期

2 ;發(fā)現(xiàn)休眠卵巢癌細(xì)胞存活機(jī)制[J];生命世界;2009年02期

3 ;美發(fā)現(xiàn)休眠卵巢癌細(xì)胞存活機(jī)制[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2009年04期

4 向君彥;夏新蜀;王昕娜;徐靜;王萍;江園;余和平;白定群;許川山;;低強(qiáng)度中頻超聲殺傷卵巢癌細(xì)胞的初步研究[J];激光雜志;2011年01期

5 陳韻仙;;下泌尿道切除作為卵巢癌細(xì)胞減少術(shù)的一部分[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè);1983年03期

6 仲任,黃瑞濱,宋善俊;組織因子途徑抑制物2對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷徙和浸潤(rùn)能力的影響[J];癌癥;2003年10期

7 ;精液能夠殺死卵巢癌細(xì)胞[J];發(fā)明與創(chuàng)新;2003年12期

8 高琨,李力,陳心秋,張瑋;雌孕激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響[J];腫瘤防治研究;2004年04期

9 王威廉,陳心秋,恩帝安,馬加薩,周德南,唐凱,黃薇;抗卵巢癌細(xì)胞膜抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)及荷瘤小鼠的體內(nèi)聚集性的實(shí)驗(yàn)研究[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

10 仲任,黃瑞濱,宋善俊;組織因子途徑抑制物2表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞浸潤(rùn)能力的實(shí)驗(yàn)研究[J];腫瘤;2004年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王文霞;孔北華;李鵬;曲迅;;蛋白酶體抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制[A];第八次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 劉娟娟;林蓓;趙越;李飛飛;郝瑩瑩;張帆;朱連成;張淑蘭;;巖藻糖基化抗原對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[A];東北三省第四屆婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

3 陳心秋;王威廉;趙芳芳;周德南;唐凱;;~(131)Ⅰ—抗卵巢癌抗體聯(lián)合外放射對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外殺傷實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆廣西腫瘤學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2003年

4 王威廉;陳心秋;恩帝安.馬加薩;周德南;唐凱;;抗卵巢癌抗體對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外細(xì)胞毒及載瘤裸鼠體內(nèi)聚集性實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆廣西腫瘤學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2003年

5 許沈華;牟瀚舟;顧琳慧;朱赤紅;劉祥麟;;高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞差異表達(dá)基因在染色體定位及其功能[A];浙江省生理科學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

6 唐東平;陳心秋;唐凱;張潔清;賀海平;;11種化療藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用及其有核細(xì)胞細(xì)胞毒性研究[A];第四屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

7 李曉峰;王欣;馬開(kāi)東;劉寶林;;卵巢癌細(xì)胞的低溫保存及致死特性研究[A];上海市制冷學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

8 梁念慈;何太平;覃燕梅;吳科鋒;;抗癌草藥半邊旗有效成分對(duì)卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響[A];第十屆全國(guó)生化與分子藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2007年

9 郝瑩瑩;林蓓;趙越;歐陽(yáng)玲;張淑蘭;;α1,2巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)婦科腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 李長(zhǎng)東;張為遠(yuǎn);苑春莉;韓麗英;;卵巢癌細(xì)胞對(duì)人樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及功能的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第一屆全球華人婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)大會(huì)暨第三次全國(guó)婦產(chǎn)科中青年醫(yī)師學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 記者 任海軍;卵巢癌為何常常復(fù)活？生死命懸一基因[N];新華每日電訊;2009年

2 靖九江;4-HPR有望用于治療卵巢癌[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

3 邰 舉;韓國(guó)醫(yī)學(xué)專家發(fā)現(xiàn)精液能夠殺死卵巢癌細(xì)胞[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

4 邰舉;精液能夠殺死卵巢癌細(xì)胞[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王萍;丙泊酚對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用中轉(zhuǎn)錄因子Slug的影響[D];山東大學(xué);2015年

2 魏星;CGI-58基因調(diào)控脂代謝介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 李曉;卵巢癌細(xì)胞影響外周血T淋巴細(xì)胞功能和分化的研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 彭萍;白細(xì)胞介素12基因轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞后和卵巢癌細(xì)胞融合作為卵巢癌腫瘤疫苗的初步研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

5 張晶晶;卵巢癌細(xì)胞與腹膜間皮細(xì)胞相互作用對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移微環(huán)境的影響[D];山東大學(xué);2006年

6 李慧慧;雌激素及其代謝物和抗壞血酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及相互影響[D];山東大學(xué);2013年

7 李留霞;基因調(diào)控溶血磷脂酸作用通路抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2008年

8 黃妍;卵泡刺激素對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

9 劉穎濤;Rab25對(duì)卵巢癌的促進(jìn)作用及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

10 李琴華;制瘤素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制的體外研究[D];吉林大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 曾麗;AKT2通過(guò)PKM2調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 雷婧;SDF-1激活PI3K-Akt通路在卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲中的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

3 牛貝貝;GDF15對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、增殖的影響及其可能機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 陳燕;卡鉑與吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3及裸鼠皮下移植腫瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 李釗;應(yīng)用葉酸受體靶向} 米載體增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞光動(dòng)力殺傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

6 劉瑞寒;塞來(lái)昔布誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

7 侯棟;PARP1在卵巢癌的表達(dá)及抗氧化作用研究[D];山東大學(xué);2015年

8 周靜;PADI4基因?qū)Σ煌琾53狀態(tài)的卵巢癌細(xì)胞系生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響[D];山東大學(xué);2015年

9 林怡君;樺木酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞CA0V3凋亡機(jī)制的研究[D];延邊大學(xué);2015年

10 姜霞;miR-182對(duì)瘦素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及調(diào)控機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：872817