本文關(guān)鍵詞：賴氨酸特異性去甲基化酶1參與卵巢癌細胞對順鉑敏感性的研究

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【摘要】：目的初步研究傳統(tǒng)化療藥物順鉑對上皮源性卵巢癌細胞SKOV3中組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(Lysine Specific Demethylase 1,LSD1)蛋白表達量的調(diào)節(jié)及其對腫瘤細胞形態(tài)功能學(xué)的影響;運用基因分子克隆技術(shù)構(gòu)建LSD1干擾及過表達的卵巢癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,分別從細胞增殖、遷移和凋亡三方面探討靶向調(diào)控LSD1基因表達在卵巢癌細胞對順鉑敏感性中的作用。方法(1)觀察在濃度梯度的順鉑處理下卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、凋亡的形態(tài)功能學(xué)變化,采用Western blot法檢測不同濃度順鉑影響下三大功能學(xué)相關(guān)指標(biāo)蛋白水平的改變和LSD1及其特異性反應(yīng)底物組蛋白H3K4甲基化蛋白表達量的變化情況,并篩選出順鉑作用的最佳濃度,用于后續(xù)實驗研究。(2)擴增、抽提LSD1干擾和過表達質(zhì)粒,通過瓊脂糖凝膠電泳法測定所提各質(zhì)粒的純度和驗證堿基量的大小。采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行慢病毒包裝,獲得兩種高滴度的LSD1干擾和過表達慢病毒顆粒,分別感染卵巢癌SKOV3細胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默LSD1表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株、經(jīng)嘌呤霉素和遺傳霉素G418篩選獲得LSD1過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,選擇多西環(huán)素最適工作濃度并誘導(dǎo)卵巢癌細胞中目的基因序列的表達,運用Western blot法鑒定兩種SKOV3體外穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型是否成功構(gòu)建。(3)將LSD1干擾和過表達的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型作為研究對象,按多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)/不誘導(dǎo)、順鉑(Cisplatin)處理/不處理分為四組,通過MTT實驗和Ed U試劑盒檢測腫瘤細胞增殖能力的變化、Transwell小室實驗觀測腫瘤細胞遷移能力的改變、Annexin V/PI雙標(biāo)法細胞染色并經(jīng)流式細胞儀上機檢測細胞凋亡的情況。此外,進一步通過Western blot法從分子水平檢測細胞增殖、遷移、凋亡相關(guān)蛋白相對表達量的變化情況,從而探究靶向調(diào)控LSD1基因表達在卵巢癌細胞對順鉑敏感性中的作用。結(jié)果(1)從形態(tài)功能學(xué)和蛋白表達水平分析,在順鉑作用下卵巢癌細胞增殖、遷移能力明顯減弱、細胞凋亡數(shù)量顯著增加;腫瘤細胞中LSD1相對表達量以順鉑濃度依賴的方式降低,其特異性反應(yīng)底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達量逐漸升高,而H3K4me3無明顯變化趨勢。(2)實驗所構(gòu)建的慢病毒介導(dǎo)干擾LSD1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株在經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)后LSD1相對表達水平降低,而過表達的SKOV3細胞株經(jīng)誘導(dǎo)后可見LSD1的相對表達水平升高,表明成功干預(yù)LSD1基因在卵巢癌細胞SKOV3中的表達。(3)慢病毒沉默LSD1表達的卵巢癌SKOV3細胞株中,干擾LSD1的表達可以抑制細胞增殖、遷移,并促進細胞凋亡;而LSD1過表達細胞株則與之相反,可以促進細胞生長、遷移,抑制細胞的程序性死亡。此外,沉默LSD1的表達可以促進順鉑所誘導(dǎo)的細胞凋亡,增加順鉑對腫瘤細胞的增殖和遷移抑制率;而LSD1的過表達則增加了卵巢癌細胞對順鉑的抵抗作用。結(jié)論本研究證實順鉑能夠調(diào)節(jié)SKOV3細胞中LSD1及其甲基化底物H3K4me1、H3K4me2的表達,抑制細胞增殖、遷移能力,并促進細胞凋亡;成功構(gòu)建靶向干擾和過表達LSD1的兩種卵巢癌SKOV3體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型,分別能有效沉默和過表達腫瘤細胞中的靶基因LSD1;靶向干擾LSD1的表達能協(xié)同增加順鉑抑制細胞增殖、遷移以及誘導(dǎo)細胞凋亡的能力,能增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性,增強順鉑對腫瘤細胞的殺傷力;而LSD1過表達能拮抗順鉑促進細胞凋亡的能力,降低順鉑對癌細胞生長和遷移的抑制率,增加卵巢癌細胞對順鉑的耐受和抵抗。以上的實驗研究發(fā)現(xiàn)為LSD1的原癌基因性質(zhì)提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：LSD1 基因分子克隆 卵巢癌細胞系SKOV3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 順鉑敏感性
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 緒論13-22
• 1.1 卵巢癌的現(xiàn)狀13-14
• 1.1.1 卵巢癌13
• 1.1.2 卵巢癌的治療13-14
• 1.2 表觀遺傳學(xué)14-15
• 1.2.1 表觀遺傳學(xué)的介紹14-15
• 1.2.2 腫瘤表觀遺傳治療15
• 1.3 LSD1的研究進展15-17
• 1.4 基因靶向治療17-20
• 1.4.1 基因克隆技術(shù)17-18
• 1.4.2 慢病毒載體p LKO Tet puro18-19
• 1.4.3 慢病毒載體p LVX-IRES-puro19-20
• 1.5 研究方案及技術(shù)路線20-22
• 1.5.1 研究方案20
• 1.5.2 技術(shù)路線20-22
• 第二章 順鉑對卵巢癌細胞功能學(xué)以及LSD1水平的影響22-40
• 2.1 實驗材料22-27
• 2.1.1 主要儀器22-23
• 2.1.2 主要試劑23-25
• 2.1.3 主要溶液25-27
• 2.2 實驗方法27-32
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)27
• 2.2.2 藥物處理27
• 2.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）27-29
• 2.2.4 MTT和Ed U試劑盒檢測細胞的增殖能力29-31
• 2.2.5 Transwell小室實驗檢測細胞的遷移能力31
• 2.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平31-32
• 2.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析32
• 2.3 實驗結(jié)果32-37
• 2.3.1 順鉑對卵巢癌細胞中LSD1表達的調(diào)節(jié)32-33
• 2.3.2 順鉑對卵巢癌細胞增殖功能的影響33-35
• 2.3.3 順鉑對卵巢癌細胞遷移能力的影響35-36
• 2.3.4 順鉑對卵巢癌細胞凋亡水平的影響36-37
• 2.4 討論37-40
• 第三章 靶向調(diào)控LSD1的卵巢癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建40-50
• 3.1 實驗材料40-43
• 3.1.1 主要儀器40-41
• 3.1.2 主要試劑41-42
• 3.1.3 主要溶液42-43
• 3.2 實驗方法43-46
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)43
• 3.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增與抽提43-44
• 3.2.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染44-45
• 3.2.4 病毒上清液感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株篩選45
• 3.2.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的鑒定45
• 3.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法45-46
• 3.3 實驗結(jié)果46-49
• 3.3.1 質(zhì)粒檢測及轉(zhuǎn)染情況46-47
• 3.3.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的鑒定結(jié)果47-49
• 3.4 討論49-50
• 第四章 靶向調(diào)控LSD1影響卵巢癌細胞對順鉑的敏感性50-62
• 4.1 實驗材料50-51
• 4.1.1 主要儀器50
• 4.1.2 主要試劑50-51
• 4.1.3 主要溶液51
• 4.2 實驗方法51-53
• 4.2.1 細胞培養(yǎng)51
• 4.2.2 藥物處理51-52
• 4.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）52
• 4.2.4 細胞增殖能力的檢測52
• 4.2.5 細胞遷移能力的檢測52-53
• 4.2.6 細胞凋亡水平的檢測53
• 4.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析53
• 4.3 實驗結(jié)果53-59
• 4.3.1 檢測LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細胞增殖的變化53-55
• 4.3.2 檢測LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細胞遷移的變化55-57
• 4.3.3 檢測LSD1干預(yù)后在順鉑處理下卵巢癌細胞凋亡的變化57-59
• 4.4 討論59-62
• 第五章 主要結(jié)論與展望62-63
• 5.1 主要結(jié)論62
• 5.2 展望62-63
• 參考文獻63-74
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文74-75
• 致謝75

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