本文關(guān)鍵詞：sFlt-1的表達(dá)及其信號通路與早發(fā)型子癇前期相關(guān)性研究

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【摘要】：目的子癇前期(Preeclampsia,PE)是一種嚴(yán)重影響母兒健康的產(chǎn)科重癥,是以高血壓、蛋白尿、水腫、多器官功能障礙為特征的一組疾病,發(fā)病率約為5%,病死率約為10%[1],是圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦及胎嬰兒死亡的重要原因。醫(yī)學(xué)界將妊娠34周前發(fā)病的子癇前期稱為早發(fā)型子癇前期(Early onset Preeclampsia,EPE),發(fā)病晚于34周者稱為晚發(fā)型子癇前期(Late onset preeclampsia,LPE)[7]。早發(fā)型比晚發(fā)型的發(fā)病早,病情重,對母兒的影響更大,各種并發(fā)癥更多,孕產(chǎn)婦預(yù)后及新生兒結(jié)局更差。因此明確早發(fā)型子癇前期的發(fā)病原因、機(jī)制、病理過程,病情的發(fā)展規(guī)律,找到有效的預(yù)防、治療方法就顯得尤為重要,并已成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。對于早發(fā)型子癇前期的治療,目前仍多以對癥治療為主[65]。發(fā)現(xiàn)有效的分子靶點(diǎn)治療是早發(fā)型子癇前期目前亟待解決的臨床問題。胎盤生長因子(PLGF)是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族成員之一,其與血管內(nèi)皮生長因子受體1(Flt-1)結(jié)合,發(fā)揮促血管生成、促絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞生長、增殖、浸潤的作用,而這種生物學(xué)過程可被可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(s Flt-1)所阻斷[26]。s Flt-1與Flt-1競爭結(jié)合VEGF,其中包括PLGF,在完全阻斷VEGF的作用同時(shí)也阻斷了PLGF的促血管生成活性,引起血管生成障礙,影響血管壁的完整性和通透性。s Flt-1對PLGF具有強(qiáng)有力的拮抗作用,對PLGF有調(diào)節(jié)作功能。有文獻(xiàn)報(bào)道s Flt-1在高血壓、糖尿病、多種腫瘤中的表達(dá)是升高的[27]。有學(xué)者提出將s Flt-1作為子癇前期的標(biāo)志物來預(yù)測病情。文獻(xiàn)提示PI3K/AKT通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物調(diào)節(jié)功能。研究表明該通路與人類血管性、代謝性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后密切相關(guān)[30]。這些研究均提示s Flt-1與PI3K/AKT通路的關(guān)聯(lián)可能成為早發(fā)型子癇前期的分子治療靶點(diǎn)。諸多研究表明細(xì)胞組織缺氧與子癇前期的發(fā)病相關(guān),許多實(shí)驗(yàn)就是利用缺氧模型進(jìn)行該病的機(jī)制研究�；诖�,本課題著重探討了早發(fā)型子癇前期患者血清、胎盤、臍帶血中s Flt-1和PLGF的表達(dá)情況,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中s Flt-1的表達(dá)情況以及缺氧培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中s Flt-1與PI3K/AKT通路的相關(guān)性。方法⑴收集西京醫(yī)院2012年9月至2014年8月收容的早發(fā)型重度子癇前期39例(ESPE組);早發(fā)型輕度子癇前期45例(EMPE組);同時(shí)期、同孕周正常妊娠病例42例(NP組),分別采集患者靜脈血、分娩時(shí)的臍帶血和胎盤。分別用ELISA法和時(shí)間分辨熒光免疫法檢測三組患者血清和臍帶血中s Flt-1和PLGF含量;用實(shí)時(shí)定量PCR檢測胎盤中s Flt-1和PLGF的m RNA的表達(dá);用Western-blot法檢測胎盤中s Flt-1和PLGF的蛋白表達(dá)。⑵采集正常妊娠人臍帶標(biāo)本,用胰酶消化法制備培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelialcells,HUVECS)。利用免疫熒光法檢測CK18,進(jìn)行了細(xì)胞鑒定。⑶建立HUVECS細(xì)胞缺氧模型,用Western-blot法檢測HIF-1α和TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡,鑒定了細(xì)胞缺氧的成功誘導(dǎo)。進(jìn)行缺氧細(xì)胞MTT檢測,為后續(xù)缺氧實(shí)驗(yàn)確定缺氧作用時(shí)間。⑷分別用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot法分別檢測s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在正常培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、缺氧培養(yǎng)24小時(shí)及LY294002作用1小時(shí)后再缺氧培養(yǎng)24小時(shí)條件下的表達(dá)。⑸用細(xì)胞流氏術(shù)測定了不同缺氧方式培養(yǎng)下的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。結(jié)果⑴早發(fā)型重度子癇前期患者血清中s Flt-1的含量均數(shù)為534.5±22.6ng/L,PLGF的含量均數(shù)為34.9±8.7ng/L;早發(fā)型輕度子癇前期患者血清中s Flt-1的含量均數(shù)為398.0±47.7 ng/L,PLGF的含量均數(shù)為51.6±10.4ng/L;同時(shí)期、同孕周正常妊娠患者血清中s Flt-1的含量均數(shù)為212.0±31.9 ng/L,PLGF的含量均數(shù)為83.3±9.3ng/L。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P0.05,三組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早發(fā)型重度子癇前期臍血血清中s Flt-1的含量均數(shù)為331.2±40.4ng/L,PLGF的含量均數(shù)為29.0±6.3ng/L;早發(fā)型輕度子癇前期臍血血清中s Flt-1的含量均數(shù)為192.0±27.7ng/L,PLGF的含量均數(shù)為41.3±5.0ng/L;同時(shí)期、同孕周正常妊娠臍血血清中s Flt-1的含量均數(shù)為98.6±13.9 ng/L,PLGF的含量均數(shù)為68.8±8.1ng/L。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P0.05,三組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組的胎盤中s Flt-1、PLGF在m RNA水平和蛋白水平均有差異,P0.05。⑵成功體外原代培養(yǎng)傳代的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞特異性表達(dá)CK18,證實(shí)構(gòu)建的細(xì)胞模型可靠,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑶m RNA和蛋白水平上s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)均在正常培養(yǎng)的HUVECS低表達(dá);在缺氧培養(yǎng)24小時(shí)HUVECS高表達(dá);在LY294002作用1小時(shí)后再缺氧培養(yǎng)24小時(shí)的HUVECS中發(fā)現(xiàn),阻斷PI3K/AKT通路的同時(shí)s Flt-1的表達(dá)也發(fā)生了下調(diào),P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流氏細(xì)胞術(shù)也證實(shí)缺氧使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了G0和G1期阻滯,G0和G1期細(xì)胞比例升高,S期比例降低,細(xì)胞凋亡增加,而LY294002的導(dǎo)入可減弱缺氧對細(xì)胞的這種抑制作用。結(jié)論s Flt-1在早發(fā)型子癇前期患者血清、臍血和胎盤中較正常妊娠對照高表達(dá),并隨著病情的加重而表達(dá)升高;PLGF在早發(fā)型子癇前期患者血清、臍血和胎盤中較正常妊娠對照低表達(dá),并隨著病情的加重而表達(dá)降低。說明其可能參與早發(fā)型子癇前期的發(fā)生發(fā)展,有可能作為該病的血清及組織學(xué)檢測指標(biāo)。s Flt-1、PI3Kp85α及p-AKT(ser473)在HUVECs缺氧模型中均出現(xiàn)了高表達(dá),說明細(xì)胞組織缺氧可能與早發(fā)型子癇前期存在某種內(nèi)在聯(lián)系,可能參與了早發(fā)型子癇前期的發(fā)病過程。PI3K/AKT通路抑制劑LY294002作用HUVECs1小時(shí)后再缺氧培養(yǎng)24小時(shí)條件下三因子的表達(dá)均下調(diào),說明PI3K/AKT通路可能參與早發(fā)型子癇前期的病理過程,可能成為有效的分子治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：早發(fā)型子癇前期 可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1 胎盤生長因子 PI3K/AKT通路 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 缺氧
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.244
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-18
• 文獻(xiàn)回顧18-23
• 實(shí)驗(yàn)一 sFlt-1、PLGF在早發(fā)型子癇前期患者血清、胎盤及臍血中的表達(dá)及臨床意義23-41
• 1 材料23-26
• 2 方法26-33
• 3 結(jié)果33-38
• 4 討論38-41
• 實(shí)驗(yàn)二 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定41-47
• 1 材料41-42
• 2 方法42-43
• 3 結(jié)果43-45
• 4 討論45-47
• 實(shí)驗(yàn)三 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型的建立47-55
• 1 材料47-48
• 2 方法48-51
• 3 結(jié)果51-53
• 4 討論53-55
• 實(shí)驗(yàn)四 sFlt-1 在缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與PI3K/AKT通路相關(guān)性研究55-72
• 1 材料55-57
• 2 方法57-63
• 3 結(jié)果63-68
• 4 討論68-72
• 小結(jié)72-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 個(gè)人簡歷和研究成果80-82
• 致謝82

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本文編號：837151