本文關(guān)鍵詞：干細(xì)胞來源的exosomes對(duì)化療誘導(dǎo)卵巢損傷保護(hù)的機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)表現(xiàn)為卵泡功能障礙,化療引起的POF已經(jīng)嚴(yán)重影響年輕女性腫瘤患者的生殖健康,研發(fā)新的防治手段刻不容緩。既有研究指出POF與卵巢顆粒細(xì)胞(Ovarian granulosa cells,OGCs)的損傷、凋亡密切相關(guān)。在臍帶組織中含有大量具有強(qiáng)大增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞,稱為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huMSCs)。HuMSCs不僅具有間充質(zhì)干細(xì)胞全部的生物學(xué)特性,同時(shí)其良好的增殖分化潛能和低免疫原性,使其成為組織工程理想的種子細(xì)胞和基因治療理想的載體細(xì)胞。許多研究發(fā)現(xiàn)huMSCs對(duì)多種組織損傷具有修復(fù)功能,更可用于POF治療,但其作用機(jī)制尚不完全明確。最新研究發(fā)現(xiàn)exosomes是一類真核細(xì)胞合成和分泌、直徑在30-200 nm之間的膜性囊泡,其通過轉(zhuǎn)移micro-RNAs以及蛋白質(zhì)來介導(dǎo)細(xì)胞之間的通訊功能。HuMSCs合成并分泌大量exosomes,經(jīng)靶細(xì)胞吞噬獲取后,達(dá)到調(diào)控靶細(xì)胞基因和蛋白的目的。故本論文探討huMSCs分泌的exosomes(huMSCs-EXO)是否為干細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)和修復(fù)作用的調(diào)控因子之一,采用分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)體外驗(yàn)證huMSCs-EXO對(duì)損傷卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)作用,并探索其分子調(diào)控機(jī)制。研究方法體外分離、培養(yǎng)、鑒定、擴(kuò)增huMSCs,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。用胰蛋白酶消化法體外分離、培養(yǎng)、大鼠來源的原代OGCs,用免疫組化方法(抗FSHR抗體染色)鑒定,并建立化療藥物(順鉑)誘導(dǎo)的OGCs損傷模型。利用梯度超速離心法或試劑提取法富集huMSCs培養(yǎng)上清中的exosomes,用透射電鏡觀察其形態(tài)大小,用Western Blotting檢測(cè)其表面標(biāo)記物。利用熒光染色在顯微鏡下觀察OGCs對(duì)exosomes的吸收和吞噬。將OGCs分為3組,對(duì)照組(A組)、順鉑損傷組(B組)、共培養(yǎng)組(C組,即用huMSCs-Exo和化療藥物順鉑同時(shí)處理OGCs),37℃、5%CO2、100%H2O條件下培養(yǎng)48 h,流式細(xì)胞儀(Annexin-IV和PI雙染)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,用Western Blotting檢測(cè)DNA修復(fù)蛋白、細(xì)胞凋亡蛋白、抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bax,Caspase-3,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP等)的表達(dá)情況,以驗(yàn)證huMSCs來源的exosomes對(duì)損傷上述細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用。研究結(jié)果體外分離培養(yǎng)huMSCs并穩(wěn)定傳代6到8代,細(xì)胞形態(tài)為梭形或多邊形,呈漩渦狀生長(zhǎng),均具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài);huMSCs表達(dá)基質(zhì)受體(CD44,CD105)和整合素(Integrin)標(biāo)記(CD29),但不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記(CD34,CD45)。體外培養(yǎng)大鼠原代OGCs,對(duì)FSHR免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的OGCs純度達(dá)到70-80%。用試劑提取法或梯度超速離心法分離富集出huc-MSCs培養(yǎng)上清中exosomes,透射電鏡下觀察到exosomes直徑為30-200 nm,呈雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)；Western Blotting檢測(cè)其表面標(biāo)記物表達(dá)CD63, CD9, Hsp70, CD81,但不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記Calnexin和溶酶體標(biāo)記Lamp 1。熒光顯微鏡下觀察到OGCs能夠吸附和結(jié)合huMSCs-Exo。流式檢測(cè)對(duì)照組(A組)活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞比例為85.50±4.45%、5.86±0.50%、8.69±2.15%；損傷組(B組)分別為71.37±3.10%、8.58±2.04%、17.26±2.67%；HucMSCs-EXO共培養(yǎng)組(C組)分別為80.09±4.00%、5.72±2.15%、10.27±1.46%。A與B、B與C組活細(xì)胞比例均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western Blotting檢測(cè)顯示B較A組凋亡蛋白Bax, Cleaved Caspase-3增多,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少,DNA修復(fù)相關(guān)蛋白Cleaved PARP增多,均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；而C較B組Bax,Cleaved Caspase-3, Cleaved PARP減少,Bcl-2表達(dá)增多,均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論及意義HuMSCs分泌的exosomes對(duì)化療誘導(dǎo)的OGCs損傷具有一定的保護(hù)作用,提示huMSCs-EXO對(duì)于預(yù)防與治療化療誘導(dǎo)的POF具有可行性,為huMSCs防治POF提供新靶點(diǎn),同時(shí)也為深入研究干細(xì)胞功能提供經(jīng)驗(yàn)和依據(jù)。本課題研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道,研究成果富有一定的創(chuàng)新,另外干細(xì)胞具有良好的臨床應(yīng)用前景,深入研究干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)和抗損傷功能的作用機(jī)制也符合“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”的研究宗旨。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 Exosomes 卵巢顆粒細(xì)胞 卵巢早衰 保護(hù)機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R711.75
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號(hào)說明12-13
• 前言13-17
• 材料方法17-32
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法20-32
• 第一部分 細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定21-23
• 第二部分 HuMSCs-EXO的提取,富集和鑒定23-27
• 第三部分 HuMSCs-EXO對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的作用27-32
• 結(jié)果32-35
• 討論35-40
• 結(jié)論40-41
• 附圖41-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 致謝56-58
• 發(fā)表論文58-59
• 附件59

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6 楊s

本文編號(hào)：806747