本文關(guān)鍵詞：胎兒血紅蛋白F增高的分子機理研究

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【摘要】：研究背景與目的血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是人體內(nèi)氧的運輸體,由血紅素和珠蛋白組成。珠蛋白是由兩條a珠蛋白鏈(αξ)和兩條非α珠蛋白鏈(βγδε)組成的四聚體。在人體不同的發(fā)育時期,α與β珠蛋白基因簇沿5’到3’端的方向依次表達(dá),生成人體不同時期的類α珠蛋白鏈與類p珠蛋白鏈。在胚胎期為Hb Grower 1 (ζ2ε2), Hb Grower2(a2ε2)及Hb Portland (ζ2γ2);在成人期及胎兒期為HbA(α2β2), HbA2(a2δ2)和HbF (α2γ2)。γ鏈有2種亞型,即Gγ和Aγ,因而組成HbF有兩類：α2Gγ2和α2Aγ2,兩者高度相似,只是前者的第136位氨酸為甘氨酸,而后者則為丙氨酸。正常成人血紅蛋白的主要成份是HbA占96.5%～97.5%；其余成分為：血紅HbA2占2.5%-3.5%；HbF為1%以下。出生時HbF占循環(huán)血紅蛋白的90%,其合成下降始于孕晚期,而在生命的第一年,它逐漸被HbA所替代。當(dāng)成人體內(nèi)HBF占人體內(nèi)血紅蛋白的比例大于2%時,就認(rèn)為HBF增高。當(dāng)成人體內(nèi)持續(xù)存在過量的HbF時,就稱為遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白增高癥(Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)。HbF的增高并不全是HPFH,一般認(rèn)為只有那些原發(fā)性非α鏈珠蛋白基因缺陷所引起的HbF水平增高的情況,才稱之為HPFH, HPFH通常具有較高水平的HbF。組成HbF的Gγ-鏈和Aγ-鏈胎兒期的比例是70：30,在一歲以后及成人期,兩者比例轉(zhuǎn)變成40：60。能影響到α,β及γ這三條珠蛋白鏈的因素都可以導(dǎo)致其組成比例失調(diào),其是HbF水平增高的分子學(xué)基礎(chǔ)。β-類珠蛋白基因的遺傳缺陷的一直以來都是HbF增高的重要學(xué)說。由于β珠蛋白基因主要在出生后才有很高的表達(dá)水平,其基因突變(包含β基因的點突變與類β基因簇的刪除突變)會使其受到不同程度的抑制作用而不能表達(dá)或很低水平表達(dá),導(dǎo)致類β珠蛋白基因簇的γ珠蛋白基因重新開放,合成過多的γ鏈。γ珠蛋白基因啟動子區(qū)的點突變能夠產(chǎn)生了一個促進子元件GGGPyG(Py=嘧啶堿基),或突變令其具有類似于CACCC盒的特征,對蛋白因子CPI的結(jié)合能力增強,或突變削弱了CAAT盒可充當(dāng)負(fù)性調(diào)控的有效性,這就可以增加γ基因的表達(dá)水平,增強γ珠蛋白的轉(zhuǎn)錄效率。α珠蛋白基因的拷貝數(shù)變異也是HbF增高的一個重要影響因素,正常個體中存在4個α珠蛋白基因,α珠蛋白基因的拷貝數(shù)丟失或突變會導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表型。α珠蛋白基因的拷貝數(shù)增加會產(chǎn)生5個拷貝的α珠蛋白基因(aaaanti307 /aa或aaaaanti4.2 /aa),這一額外增加的的α珠蛋白基因會產(chǎn)生過多的α鏈,加重α與β鏈的失衡,加重β地貧患者的臨床癥狀。遺傳修飾在HbF增高中起了重要的調(diào)節(jié)作用,γ基因某些位點(如Gγ-158 C/T位點)的多態(tài)性及β珠蛋白基因簇非連鎖的數(shù)量性狀位點(如發(fā)現(xiàn)HBFQTL2-6q23跨度1.5 Mb區(qū)域與HbF數(shù)量性狀相關(guān),參與γ-球蛋白基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,參與紅細(xì)胞的生成過程)與HbF增高密切關(guān)聯(lián)。目前,國外對HbF增高的分子機制研究處于系統(tǒng)有序的狀態(tài),多數(shù)報道都從影響HbF增高的因素出發(fā),采用多方法多手段進行深入的研究分析,且發(fā)現(xiàn)不同人種間導(dǎo)致HbF增高的基因突變類型有所差別且種族間的基因突變熱區(qū)不一、與HbF相關(guān)量的遺傳修飾因素也存在明顯差異。國內(nèi)對HbF增高分子機制研究尚處于初級階段,系統(tǒng)研究尚屬較少,多見的是對某一方面影響因素的研究。本研究的目的在于：1.較為系統(tǒng)闡明HBF增高的分子機理,豐富對中國人群HbF增高發(fā)生機制的研究；2. 深入分析β-類珠蛋白基因的遺傳缺陷在HbF增高病例中所起的作用,檢測β-珠蛋白基因簇的突變類型,明確基因突變在β基因簇的起始位置,有利于分析基因突變所帶來的遺傳效應(yīng)；3.檢測α珠蛋白基因的拷貝數(shù)變異,闡述α珠蛋白基因拷貝數(shù)丟失與增加對HbF的影響,分析其影響HbF水平的分子機制；4. 對中國人群常見的HbF遺傳修飾位點行實驗學(xué)分析,分析常見修飾調(diào)控位點在所選病例中的作用；5.基因突變類型與HbF增高水平的差異性分析。材料與方法本研究的樣本來自近年來因貧血到南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院就診的患者,在分析患者血液表觀學(xué)檢查結(jié)果后,在限定PH8.6瓊脂糖血紅蛋白電泳HbF增高水平大于5%,患者年齡大于2周歲且沒有患有再生性障礙性貧血等貧血性疾病等條件下,排除患者為孕婦,共收集HbF增高的病例85例。本研究方法分為四個部分：1.β-珠蛋白鏈基因簇突變分析：a.采用反向點雜交(RDB)行中國人群常見17個β-珠蛋白基因突變位點分析；b.應(yīng)用多重探針連接擴增技術(shù)(ligation-dependent probe amplification, MLPA)對β-珠蛋白鏈基因簇行大片段缺失分析,采用Gap-PCR技術(shù)對SEA型HPFH和中國型δp地中海貧血進行驗證；c.應(yīng)用sanger測序法對β珠蛋白基因全長測序分析。2.α-珠蛋白鏈拷貝數(shù)變異分析：a.采用Gap-PCR技術(shù)檢測中國人群α地貧-SEA/、-α3.7/、-α4.2/缺失型致病基因；b.應(yīng)用MLPA對α-珠蛋白鏈基因簇行大片段重復(fù)分析。3.調(diào)控修飾位點分析：Gγ珠蛋白基因上游-158處Xmn Ⅰ位點酶切分析。(4)對HbF增高病例行基因突變類型分析：用卡方檢驗分析基因突變類型與臨床表型的關(guān)系。實驗結(jié)果本研究的實驗結(jié)果分為八個部分表述：1.對所有納入本研究的85個HbF增高的病例均檢測了α地貧--SEA/、-α3.7/、-α4.2/三中基因缺失型,共檢出--SEA缺失雜合子2例,在檢出的2例樣本中,都復(fù)合有β地貧；2.用于本研究的所有病例均作PCR擴增β珠蛋白基因用于RDB檢測,檢出正�；蛐�16例,突變雜合子26例,突變純合子8例,突變雙重雜合子35例。這些突變都較為集中的分布在中國人群南方地區(qū)的最常見的突變位點,為編碼區(qū)(Code, CD) 41-42 (-TCTT),內(nèi)含子區(qū)域IVS-2-654 (C-T), TATA box-28 (A-G), CD17 (A-T);3.21個病例采用了MLPA KIT P102檢測β珠蛋白基因簇大片段缺失突變,檢測出HBB大片段缺失雜合子15例。經(jīng)查詢?nèi)祟愌t蛋白與地中海貧血數(shù)據(jù)庫及采用Gap-PCR來驗證SEA-HPFH和中國型δβ地貧后,發(fā)現(xiàn)Gγ(Aγδβ)0雜合10例,SEA-HPFH缺失3例,Ducth I 1例,1例缺失類型未明確；4.采用MLPA KIT P140檢測α珠蛋白基因的拷貝數(shù)變異的6個樣本中,檢測出2例樣本存在α珠蛋白基因簇大片段重復(fù),2例病例存在α珠蛋白基因簇缺失。其中,1例樣本為aaaant3.7三聯(lián)體,1例樣本重復(fù)發(fā)生在ζ與Ψζ基因之間,1例樣本在ζ基因上游—9.3 kb處發(fā)生雜合性缺失,1例樣本在α1基因上游與a2基因之間發(fā)生雜合性缺失；5.Gy-158 (C/T)位點行XmnI酶切的21個樣本中,13例為-/-(基因型為C/C),6例為+/-(T/C雜合狀態(tài)),僅有1例為+/+(T/T純合)：6.用于p基因全長測序分析的6個樣本中,除合并RDB檢測已發(fā)現(xiàn)p基因CD41-42與IVS2-654突變外,測序分析沒有發(fā)現(xiàn)明顯的致病突變,卻發(fā)現(xiàn)3例樣本中存在SNP, SNP為rs1609812與rs 7480526 (Hg19, dbSNP build 138); 7.綜合所用的實驗方法后,遺傳修飾因素及測序結(jié)果致病性不確定的不在本綜合分析內(nèi)。在85例樣本中,檢測出p基因雜合突變22例,p基因雙重雜合突變34例,純合突變6例：p基因簇大片段缺失12例,其中Gy(Aγδβ)0型9例,SEA-HPFH 2例,Ducth I 1例；p基因雜合突變復(fù)合p基因簇大片段缺失3例, α地貧--SEA缺失型復(fù)合po/βα或β0/β+2例,1例pIVS-2-654復(fù)合a基因簇缺失,1例pCD41-42復(fù)合aaaant3.7三聯(lián)體,α基因簇缺失與重復(fù)各1例；8.運用卡方檢驗發(fā)現(xiàn),在HBF增高水平方面,β基因雜合突變與β基因簇大片段缺失在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著差異,β基因雙重雜合突變與β基因純合突變在統(tǒng)計上無顯著性差異。結(jié)論1.β珠蛋白基因存在轉(zhuǎn)錄突變、RNA加工區(qū)突變、RNA翻譯區(qū)突變可導(dǎo)致β珠蛋白合成受到抑制,β鏈生成減少,導(dǎo)致β與α比例的失衡,為修正這種失衡,出生后關(guān)閉的Y基因重新開放,Y珠蛋白合成增多,生成的γ鏈與過量的α鏈組成四聚體(α2γ2),從而導(dǎo)致HbF水平的升高；2.α拷貝數(shù)的增多會加重α鏈與β鏈的不平衡性,加重α鏈與β鏈的不平衡性,同時過多α鏈與γ鏈組成過量的HbF,導(dǎo)致HbF水平的升高；α拷貝數(shù)的減少會修正α與β鏈比例的失衡,從而減輕β地貧突變的純合子或雙重雜合子貧血癥狀,從而這類病例歸類為中間型β地貧,導(dǎo)致HbF水平的升高；3.Gγ-158位點(C/T)突變也可以使正常成年人HbF輕度增高,是低Hb F水平?jīng)Q定因素之一,在β地貧雜合子中,Hb F往往處于較低水平的狀態(tài),然而,合并該位點的突變能夠增加γ-珠蛋白的表達(dá),促進γ鏈的生成,導(dǎo)致Hb F偏向于中等水平。在中間型地貧中,其能調(diào)節(jié)HbF,使HbF邁向更高的水平；4.相對于β基因雜合突變,β基因簇大片段缺失具有更高HbF水平,而β基因雙重雜合突變與p基因純合突變在HbF水平上則無明顯差異;5.β基因上的一些多態(tài)性位點對HbF水平的影響性尚屬不太清楚。沒有對反式調(diào)控HbF的β基因簇外的一些數(shù)量性狀位點與類β珠蛋白基因Gγ、Aγ進行分析是本研究的不足之處。
【關(guān)鍵詞】：血紅蛋白F增高 β珠蛋白基因簇基因突變 α珠蛋白基因拷貝數(shù)變異Gγ-158(C-T) 多態(tài)性 多重連接探針擴增技術(shù) (MLPA)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.5
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第1章 前言16-23
• (一) 人類血紅蛋白的組成與功能16-18
• (二) 正常人體內(nèi)的血紅蛋白的組成與HbF增高的定義18
• (三) HbF增高的分子基礎(chǔ)18-21
• (四) 國內(nèi)對HbF增高的研究狀況與存在的問題21
• (五) 本研究的目的21-22
• (六) 本研究的內(nèi)容指標(biāo)22-23
• 第2章 實驗材料23-27
• 2.1 研究對象23
• 2.1.1 病例信息23
• 2.1.2 樣本的采集23
• 2.2 實驗所使用的主要試劑23-25
• 2.3 主要儀器25-26
• 2.4 數(shù)據(jù)分析軟件及數(shù)據(jù)庫26-27
• 第3章 實驗方法27-42
• 3.1 本研究所采取的技術(shù)路線27-29
• 3.2 外周血DNA的提取29-30
• 3.3 Gap-PCR檢測α地貧--SEA/、--α3.7/、-α4.2/缺失型基因30-31
• 3.4 PCR擴增β珠蛋白基因用于RDB檢測31-33
• 3.5 MLPA檢測β珠蛋白基因簇大片段缺失與α珠蛋白基因簇大片段重復(fù)33-36
• 3.6 Gap-PCR驗證SEA型HPFH和中國型δβ地貧36-38
• 3.7 ~Gγ珠蛋白基因-158位點Xmn Ⅰ酶切分析38-39
• 3.8 β珠蛋白基因全長測序分析39-41
• 3.9 統(tǒng)計學(xué)方法41-42
• 第4章 實驗結(jié)果42-69
• 4.1 α地貧--~(SEA/)、-α~(3.7)/、-α~(4.2/)缺失型基因檢測結(jié)果42-43
• 4.2 β珠蛋白基因PCR擴增結(jié)果43-44
• 4.3 MLPA檢測β珠蛋白基因簇大片段缺失與Gap-PCR驗證結(jié)果44-53
• 4.3.1 β珠蛋白基因簇大片段缺失MLPA檢測結(jié)果44-51
• 4.3.2 SEA型HPFH和中國型δβ地貧的Gap-PCR驗證結(jié)果51-53
• 4.4 α珠蛋白基因拷貝數(shù)變異的MLPA檢測結(jié)果53-54
• 4.5 Gγ-158(C/T)位點Xmn Ⅰ酶切結(jié)果54-56
• 4.6 β珠蛋白基因全長測序分析結(jié)果56-58
• 4.7 綜合分析結(jié)果58-65
• 4.8 統(tǒng)計學(xué)方法分析基因型與臨床表型的關(guān)系65-69
• 4.8.1 β基因雜合突變與β基因簇大片段缺失HbF水平差異性分析結(jié)果65-66
• 4.8.2 β基因雙重雜合突變與β基因純合突變HbF水平差異性分析結(jié)果66-67
• 4.8.3 不同性別間HbF水平差異性分析結(jié)果67
• 4.8.4 不同年齡間HbF水平差異性分析結(jié)果67-69
• 第5章 分析與討論69-79
• 5.1 β珠蛋白基因點突變對HbF水平的影響69-73
• 5.2 β珠蛋白基因簇大片段缺失對HbF水平的影響73-75
• 5.3 α 珠蛋白基因簇突變對HbF水平的影響75-76
• 5.4 Gγ珠蛋白基因-158位點的多態(tài)性對HbF水平的影響76-77
• 5.5 HbF水平增高病例的基因突變分布77-79
• 第6章 全文小結(jié)79-84
• 參考文獻(xiàn)84-93
• 附錄 英文縮略詞表93-95
• 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表論文95-96
• 致謝96-97

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 顧援朝;;遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合征[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1980年04期

2 石之歂,王沙燕,戴勇;地中海貧血分子診斷的研究進展[J];中國生育健康雜志;2003年03期

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本文編號：804704