發(fā)布時間：2017-09-03 04:28

  本文關(guān)鍵詞：HDAC1對分娩啟動前后人子宮平滑肌細胞PR影響及機制研究

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【摘要】：研究背景與目的人類的妊娠和分娩是極其復(fù)雜的生理過程。妊娠子宮平滑肌由靜息轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮收縮狀態(tài)啟動分娩,其具體機制尚不明確,目前仍是臨床研究熱點之一。孕激素是維持妊娠子宮平滑肌處于靜息即舒張狀態(tài)的重要激素,當(dāng)孕激素的這種功能被阻斷后分娩發(fā)生。人類不同于大多數(shù)靈長類的是分娩啟動時母體血漿孕激素水平并未下降,仍然維持高水平。研究發(fā)現(xiàn)孕激素受體(PR)阻斷劑,例如RU486,卻可以使妊娠子宮收縮導(dǎo)致分娩,于是人們提出了“功能性孕激素撤退”來解釋人類和部分靈長類的分娩啟動機制。目前研究認為眾多“功能性孕激素撤退”的原因中重要因素之一是:孕激素受體亞型(PRs)表達失調(diào),導(dǎo)致子宮對孕激素敏感性降低。PR基因位于11q22-23,含8個外顯子,長度大約90kb,主要有PRA、PRB兩種亞型。PRA基因是PRB的縮短版,其N端缺少164個氨基酸,PRA、PRB亞型的表達由來自于單個基因轉(zhuǎn)錄而來的兩個獨立的啟動子控制,因此PRA和PRB功能不同:PRB作為PR基因全長版本受體,介導(dǎo)孕激素的大多數(shù)作用,比如維系子宮處于靜息狀態(tài),而PRA則抑制PRB此種功能。近期大量研究表明人類妊娠晚期相對于PRB,PRA表達上升,PRA/PRB相對比值上升進而啟動分娩,產(chǎn)程開始。然而調(diào)節(jié)PR亞型發(fā)生此種改變的機制尚不清楚。近來有研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期子宮平滑肌組織,相比于PRB,PRA啟動子區(qū)乙酰化水平顯著升高,這給表觀遺傳學(xué)調(diào)控“孕激素功能性撤退”提供一種可能性。組蛋白乙酰化通過組蛋白乙�；�(HATs)和去乙�；�(HDACs)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而,具體是那些酶作用于PRA基因啟動子,使其乙酰化水平升高仍需進一步研究。同時乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)HDAC,尤其HDAC1,能與雌激素受體(ERα)啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)ER表達。真核生物根據(jù)序列同源性,HDACs家族分為四大類,主要位于細胞核和細胞質(zhì),少部分種類位于細胞器。HDACs家族成員結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能各不相同,其中人HDAC1屬于Ⅰ類HDACs成員,和酵母Rpd3/Sdi2/Sds6具有同源性。我們前期預(yù)實驗分析臨產(chǎn)孕婦子宮發(fā)現(xiàn)伴隨著PRA表達升高,HDACsⅠ類成員HDAC1顯著下降。結(jié)合近期國內(nèi)外研究,我們推測HDAC1可能參與PR調(diào)控,通過表觀修飾PR參與分娩發(fā)動過程。因此,我們設(shè)計實驗,展開研究。以期初步探索人類分娩啟動的表觀遺傳相關(guān)機制,為早產(chǎn)、過期產(chǎn)的預(yù)防和治療提供依據(jù)。1實驗方法1.1比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達,及PRA/PRB值變化。收集臨產(chǎn)組和未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌分別為實驗組和對照組,提取組織m RNA和核蛋白,行RT-PCR比較兩組標本HDAC1、PRA和PRB的m RNA水平,計算兩組標本PRA/PRB值,并western blot檢測比較實驗組和對照組三種蛋白的表達水平。1.2分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細胞(HUt SMCs)取組織塊用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代細胞,并用免疫熒光法和western blot檢測人妊娠子宮平滑肌蛋白標志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC在培養(yǎng)細胞中的表達。1.3構(gòu)建HDAC1干擾(HDAC1-RNAi)質(zhì)粒和HDAC1過表達質(zhì)粒英俊公司設(shè)計和構(gòu)建沉默HDAC1表達的HDAC1-RNAi質(zhì)粒和HDAC1過表達質(zhì)粒。1.4 HDAC1干擾質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUt SMCs取P4代HUt SMCs,電穿孔法轉(zhuǎn)染HDAC1干擾質(zhì)粒、過表達質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒。流式細胞儀測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。1.5檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化原代細胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后,RT-PCR分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA表達變化,及PRA/PRB比值變化,western blot方法檢測三個基因的蛋白水平變化。1.6檢測過表達HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化原代細胞轉(zhuǎn)染過表達粒后,RT-PCR技術(shù)和western blot方法分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA和蛋白表達變化,及PRA/PRB比值變化。1.7 HDAC1調(diào)控PRs的機制研究Ch IP分析比較干擾組、過表組和對照組HDAC1在PRA、PRB啟動子區(qū)富集量。1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用Graph Pad Prism5軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均先行正態(tài)性檢驗,并以平均值±標準偏差(SD)表示。雙尾Student’t檢驗比較兩組間差異。2實驗結(jié)果2.1比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達,及PRA/PRB值變化。m RNA水平和蛋白水平分析兩組樣本:(1)臨產(chǎn)組PRA的表達顯著高于未臨產(chǎn)組;(2)兩組間PRB的表達水平無顯著統(tǒng)計學(xué)差異;(3)臨產(chǎn)組PRA/PRB的值明顯高于未臨產(chǎn)組;(4)臨產(chǎn)組HDAC1的水平明顯降低,低于未臨產(chǎn)組。2.2分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細胞(HUt SMCs)倒置顯微鏡下觀察,樣本組織可見典型長梭形肌纖維;原代細胞呈長梭行生長;細胞免疫熒光法和western blot檢測發(fā)現(xiàn)大量人子宮平滑肌蛋白標志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC于原代細胞中的表達。2.3 HDAC1干擾質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUt SMCs免疫熒光顯微鏡及流式細胞儀,見實驗組和陰性對照組細胞表達大量綠色熒光,測得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率60%以上。2.4檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化干擾HUt SMCs的HDAC1表達,PRA基因的m RNA和蛋白表達升高;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值升高。2.5檢測過表達HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化過表達HDAC1,PRA基因的m RNA和蛋白表達降低;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值下降。2.6 HDAC1調(diào)控PRs的機制研究CHIP檢測發(fā)現(xiàn),干擾組HDAC1在PRA啟動子區(qū)富集量明顯減少;過表達組,其HDAC1在PRA啟動子區(qū)富集量顯著增多。干擾組、過表達組、對照組HDAC1在PRB啟動子區(qū)富集量無明顯變化。3結(jié)論1.PRA基因表達升高及PRA/PRB比值升高是產(chǎn)程啟動的關(guān)鍵因素之一。2.HDAC1結(jié)合于PRA啟動子區(qū)調(diào)控PRA基因表達,而對PRB無顯著調(diào)控作用。3.HDAC1通過表觀遺傳修飾調(diào)控PRA的表達參與分娩啟動機制。
【關(guān)鍵詞】：HDAC1 分娩啟動 孕激素受體 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 PRs、HDAC1在分娩啟動前后子宮平滑肌中的表達差異15-23
• 2.1 材料和方法15-20
• 2.2 實驗結(jié)果20-21
• 2.3 討論21-22
• 2.4 小結(jié)22-23
• 第三章 沉默及過表達HUt SMCs的HDAC1對PRs表達的影響23-34
• 3.1 材料和方法23-26
• 3.2 實驗結(jié)果26-32
• 3.3 討論32-33
• 3.4 小結(jié)33-34
• 第四章 HDAC1調(diào)控PRs的機制研究34-39
• 4.1 材料和方法34-36
• 4.2 實驗結(jié)果36-37
• 4.3 討論37-38
• 4.4 小結(jié)38-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻40-44
• 文獻綜述 孕激素受體的表觀遺傳學(xué)研究進展44-53
• 參考文獻49-53
• 在讀期間發(fā)表及擬發(fā)表論文53-54
• 致謝54

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