本文關(guān)鍵詞：HDAC1對分娩啟動(dòng)前后人子宮平滑肌細(xì)胞PR影響及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： HDAC1 分娩啟動(dòng) 孕激素受體 表觀遺傳學(xué)

【摘要】：研究背景與目的人類的妊娠和分娩是極其復(fù)雜的生理過程。妊娠子宮平滑肌由靜息轉(zhuǎn)變?yōu)榕d奮收縮狀態(tài)啟動(dòng)分娩,其具體機(jī)制尚不明確,目前仍是臨床研究熱點(diǎn)之一。孕激素是維持妊娠子宮平滑肌處于靜息即舒張狀態(tài)的重要激素,當(dāng)孕激素的這種功能被阻斷后分娩發(fā)生。人類不同于大多數(shù)靈長類的是分娩啟動(dòng)時(shí)母體血漿孕激素水平并未下降,仍然維持高水平。研究發(fā)現(xiàn)孕激素受體(PR)阻斷劑,例如RU486,卻可以使妊娠子宮收縮導(dǎo)致分娩,于是人們提出了“功能性孕激素撤退”來解釋人類和部分靈長類的分娩啟動(dòng)機(jī)制。目前研究認(rèn)為眾多“功能性孕激素撤退”的原因中重要因素之一是:孕激素受體亞型(PRs)表達(dá)失調(diào),導(dǎo)致子宮對孕激素敏感性降低。PR基因位于11q22-23,含8個(gè)外顯子,長度大約90kb,主要有PRA、PRB兩種亞型。PRA基因是PRB的縮短版,其N端缺少164個(gè)氨基酸,PRA、PRB亞型的表達(dá)由來自于單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄而來的兩個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子控制,因此PRA和PRB功能不同:PRB作為PR基因全長版本受體,介導(dǎo)孕激素的大多數(shù)作用,比如維系子宮處于靜息狀態(tài),而PRA則抑制PRB此種功能。近期大量研究表明人類妊娠晚期相對于PRB,PRA表達(dá)上升,PRA/PRB相對比值上升進(jìn)而啟動(dòng)分娩,產(chǎn)程開始。然而調(diào)節(jié)PR亞型發(fā)生此種改變的機(jī)制尚不清楚。近來有研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期子宮平滑肌組織,相比于PRB,PRA啟動(dòng)子區(qū)乙�；斤@著升高,這給表觀遺傳學(xué)調(diào)控“孕激素功能性撤退”提供一種可能性。組蛋白乙�；ㄟ^組蛋白乙�；�(HATs)和去乙�；�(HDACs)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而,具體是那些酶作用于PRA基因啟動(dòng)子,使其乙�；缴呷孕柽M(jìn)一步研究。同時(shí)乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)HDAC,尤其HDAC1,能與雌激素受體(ERα)啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)ER表達(dá)。真核生物根據(jù)序列同源性,HDACs家族分為四大類,主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),少部分種類位于細(xì)胞器。HDACs家族成員結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能各不相同,其中人HDAC1屬于Ⅰ類HDACs成員,和酵母Rpd3/Sdi2/Sds6具有同源性。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)分析臨產(chǎn)孕婦子宮發(fā)現(xiàn)伴隨著PRA表達(dá)升高,HDACsⅠ類成員HDAC1顯著下降。結(jié)合近期國內(nèi)外研究,我們推測HDAC1可能參與PR調(diào)控,通過表觀修飾PR參與分娩發(fā)動(dòng)過程。因此,我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),展開研究。以期初步探索人類分娩啟動(dòng)的表觀遺傳相關(guān)機(jī)制,為早產(chǎn)、過期產(chǎn)的預(yù)防和治療提供依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)方法1.1比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達(dá),及PRA/PRB值變化。收集臨產(chǎn)組和未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組,提取組織m RNA和核蛋白,行RT-PCR比較兩組標(biāo)本HDAC1、PRA和PRB的m RNA水平,計(jì)算兩組標(biāo)本PRA/PRB值,并western blot檢測比較實(shí)驗(yàn)組和對照組三種蛋白的表達(dá)水平。1.2分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細(xì)胞(HUt SMCs)取組織塊用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞,并用免疫熒光法和western blot檢測人妊娠子宮平滑肌蛋白標(biāo)志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。1.3構(gòu)建HDAC1干擾(HDAC1-RNAi)質(zhì)粒和HDAC1過表達(dá)質(zhì)粒英俊公司設(shè)計(jì)和構(gòu)建沉默HDAC1表達(dá)的HDAC1-RNAi質(zhì)粒和HDAC1過表達(dá)質(zhì)粒。1.4 HDAC1干擾質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUt SMCs取P4代HUt SMCs,電穿孔法轉(zhuǎn)染HDAC1干擾質(zhì)粒、過表達(dá)質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒。流式細(xì)胞儀測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。1.5檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后,RT-PCR分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA表達(dá)變化,及PRA/PRB比值變化,western blot方法檢測三個(gè)基因的蛋白水平變化。1.6檢測過表達(dá)HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)粒后,RT-PCR技術(shù)和western blot方法分析HDAC1、PRA和PRB的m RNA和蛋白表達(dá)變化,及PRA/PRB比值變化。1.7 HDAC1調(diào)控PRs的機(jī)制研究Ch IP分析比較干擾組、過表組和對照組HDAC1在PRA、PRB啟動(dòng)子區(qū)富集量。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graph Pad Prism5軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均先行正態(tài)性檢驗(yàn),并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。雙尾Student’t檢驗(yàn)比較兩組間差異。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1比較臨產(chǎn)組、未臨產(chǎn)組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達(dá),及PRA/PRB值變化。m RNA水平和蛋白水平分析兩組樣本:(1)臨產(chǎn)組PRA的表達(dá)顯著高于未臨產(chǎn)組;(2)兩組間PRB的表達(dá)水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(3)臨產(chǎn)組PRA/PRB的值明顯高于未臨產(chǎn)組;(4)臨產(chǎn)組HDAC1的水平明顯降低,低于未臨產(chǎn)組。2.2分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細(xì)胞(HUt SMCs)倒置顯微鏡下觀察,樣本組織可見典型長梭形肌纖維;原代細(xì)胞呈長梭行生長;細(xì)胞免疫熒光法和western blot檢測發(fā)現(xiàn)大量人子宮平滑肌蛋白標(biāo)志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC于原代細(xì)胞中的表達(dá)。2.3 HDAC1干擾質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUt SMCs免疫熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀,見實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組細(xì)胞表達(dá)大量綠色熒光,測得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率60%以上。2.4檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化干擾HUt SMCs的HDAC1表達(dá),PRA基因的m RNA和蛋白表達(dá)升高;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值升高。2.5檢測過表達(dá)HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達(dá)變化過表達(dá)HDAC1,PRA基因的m RNA和蛋白表達(dá)降低;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值下降。2.6 HDAC1調(diào)控PRs的機(jī)制研究CHIP檢測發(fā)現(xiàn),干擾組HDAC1在PRA啟動(dòng)子區(qū)富集量明顯減少;過表達(dá)組,其HDAC1在PRA啟動(dòng)子區(qū)富集量顯著增多。干擾組、過表達(dá)組、對照組HDAC1在PRB啟動(dòng)子區(qū)富集量無明顯變化。3結(jié)論1.PRA基因表達(dá)升高及PRA/PRB比值升高是產(chǎn)程啟動(dòng)的關(guān)鍵因素之一。2.HDAC1結(jié)合于PRA啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控PRA基因表達(dá),而對PRB無顯著調(diào)控作用。3.HDAC1通過表觀遺傳修飾調(diào)控PRA的表達(dá)參與分娩啟動(dòng)機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：HDAC1 分娩啟動(dòng) 孕激素受體 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 PRs、HDAC1在分娩啟動(dòng)前后子宮平滑肌中的表達(dá)差異15-23
• 2.1 材料和方法15-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-21
• 2.3 討論21-22
• 2.4 小結(jié)22-23
• 第三章 沉默及過表達(dá)HUt SMCs的HDAC1對PRs表達(dá)的影響23-34
• 3.1 材料和方法23-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-32
• 3.3 討論32-33
• 3.4 小結(jié)33-34
• 第四章 HDAC1調(diào)控PRs的機(jī)制研究34-39
• 4.1 材料和方法34-36
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-37
• 4.3 討論37-38
• 4.4 小結(jié)38-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 文獻(xiàn)綜述 孕激素受體的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展44-53
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 在讀期間發(fā)表及擬發(fā)表論文53-54
• 致謝54

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