本文關(guān)鍵詞：Snail基因誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究

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【摘要】：目的:絨毛膜癌(choriocarcinoma,CC),簡(jiǎn)稱絨癌,是一種生長迅速的高度惡性腫瘤,以血行播散、轉(zhuǎn)移早而廣泛且對(duì)化療敏感為主要特征。其發(fā)病機(jī)制至今仍尚不清楚。絨癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生及對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成患者死亡的主要因素。因此,如何抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移成為研究熱點(diǎn)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指在特定的生理或病理情況下,具有極性的上皮表型細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞骨架重塑現(xiàn)象,侵襲及遷移能力增強(qiáng),上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)改變,轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)表型細(xì)胞的過程。越來越多的研究表明,EMT不僅是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育及器官形成的基礎(chǔ)過程,還與多種上皮性惡性腫瘤的局部浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此,進(jìn)一步了解EMT分子調(diào)控機(jī)制及腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,再通過各種技術(shù)干擾EMT的過程,有望為絨癌的治療提供新方向。Snail基因首先在果蠅中發(fā)現(xiàn),隨后在多種脊椎動(dòng)物包括人類中相繼識(shí)別出Snail及其同源組織。Snail及其同源組織屬于SNAIL家族,包括Snail、Slug、S1P1等。在對(duì)多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn),Snail基因通過抑制E-cadherin表達(dá)及促使N-cadherin表達(dá),誘導(dǎo)EMT的發(fā)生,腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。然而,Snail基因與絨癌細(xì)胞EMT的關(guān)系罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)絨癌JEG-3細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染Snail基因作為處理因素,觀察細(xì)胞形態(tài)、遷移能力及EMT分子標(biāo)記物的表達(dá),旨在研究Snail基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討,以期為絨癌的治療提供新思路及理論依據(jù)。方法:1培養(yǎng)人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞株;2實(shí)驗(yàn)分組:①實(shí)驗(yàn)組,應(yīng)用Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染p EGFP-N1-Snail質(zhì)粒;②陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒;③脂質(zhì)體對(duì)照組,轉(zhuǎn)染Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑;④空白對(duì)照組,無任何處理;3倒置相差顯微鏡:觀察各組JEG-3細(xì)胞形態(tài)的變化;4細(xì)胞劃痕試驗(yàn):應(yīng)用劃痕試驗(yàn)評(píng)估各組JEG-3細(xì)胞的遷移能力;5 Real-time q PCR:檢測(cè)各組JEG-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Snail-m RNA的表達(dá)水平;6 Western blotting:檢測(cè)各組JEG-3細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin的表達(dá)情況;7應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(??±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P0.05為無顯著性差異,P0.05為具有顯著性差異。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。結(jié)果:1倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果3組對(duì)照組JEG-3細(xì)胞形態(tài)多為橢圓形或圓形,細(xì)胞間排列緊密,聚集成片狀生長,呈上皮樣細(xì)胞形態(tài);實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化成梭形,極性丟失,細(xì)胞間排列變松散,表現(xiàn)為間質(zhì)樣細(xì)胞特性。證實(shí)Snail基因促使絨癌JEG-3細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,提高了絨癌JEG-3細(xì)胞的惡性侵襲力。2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的觀察經(jīng)Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞,并應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。24h后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組中均有弱熒光表達(dá)(轉(zhuǎn)染率15%~20%),48h后熒光表達(dá)均增強(qiáng)(轉(zhuǎn)染率70%~80%)。脂質(zhì)體對(duì)照組及空白對(duì)照組均無熒光表達(dá)。3細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察,實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合面積(47.32±2.32)%較空白對(duì)照組(14.9±1.21)%明顯增加,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Snail基因增強(qiáng)了JEG-3細(xì)胞遷移能力;劃痕后12小時(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增長速率為(13.04±0.72)%,空白對(duì)照組增長速率為(9.78±0.35)%,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組細(xì)胞增殖速度相似;劃痕后24小時(shí),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增長速率為(19.13±1.07)%,空白對(duì)照組增長速率為(17.59±1.02)%,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,兩組細(xì)胞增殖速度相似。三組數(shù)據(jù)比較提示實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞劃痕愈合較快是由于轉(zhuǎn)染Snail基因后細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),而非細(xì)胞生長加快的結(jié)果。4 Real-time q PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組JEG-3細(xì)胞Snail-m RNA的表達(dá)水平測(cè)定各組JEG-3細(xì)胞中Snail-m RNA的表達(dá)水平:實(shí)驗(yàn)組為2.067±0.031,陰性對(duì)照組為1.093±0.011,脂質(zhì)體對(duì)照組為1.055±0.025,空白對(duì)照組為1.001±0.021。實(shí)驗(yàn)組Snail-m RNA的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯上調(diào),P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;陰性對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照相比,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組JEG-3細(xì)胞E-cadherin及N-cadherin表達(dá)水平檢測(cè)各組JEG-3細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平:實(shí)驗(yàn)組為0.268±0.034,陰性對(duì)照組為0.645±0.020,脂質(zhì)體對(duì)照組為0.594±0.031,空白對(duì)照組為0.390±0.034。實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯下降,P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Snail基因可抑制JEG-3細(xì)胞E-cadherin的表達(dá);3個(gè)對(duì)照組之間兩兩比較,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)各組JEG-3細(xì)胞中N-cadherin的表達(dá)水平:實(shí)驗(yàn)組為0.664±0.009,陰性對(duì)照組為0.578±0.030,脂質(zhì)體對(duì)照組為0.576±0.013,空白對(duì)照組為0.581±0.020。實(shí)驗(yàn)組N-cadherin的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯上調(diào),P0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Snail基因可上調(diào)N-cadherin的表達(dá);3個(gè)對(duì)照組之間兩兩比較,P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1 Snail基因改變了絨癌JEG-3細(xì)胞形態(tài),使其呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的表型特征,增加了細(xì)胞的惡性侵襲力。2 Snail基因提高了絨癌JEG-3細(xì)胞的遷移能力,促使絨癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。3 Snail基因誘導(dǎo)絨癌JEG-3細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下降,N-cadherin表達(dá)上調(diào),證實(shí)Snail基因通過EMT機(jī)制而參與了絨癌的發(fā)生發(fā)展過程。
【關(guān)鍵詞】：Snail基因 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 絨毛膜癌 JEG-3細(xì)胞 E-cadherin N-cadherin
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-31
• 附表31-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 綜述 Snail基因與婦科惡性腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究40-47
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 致謝47-48
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷48

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