發(fā)布時間：2017-08-11 01:02

  本文關(guān)鍵詞：宮頸癌HPV E7與致癌因子CIP2A相互調(diào)控機(jī)制的初步研究及預(yù)后價值的評估

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【摘要】：研究背景宮頸癌是一種威脅婦女生命健康的常見惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居世界第二。由于發(fā)達(dá)國家癌前篩查的普及,近二十年來,宮頸癌的發(fā)病率明顯降低；而在發(fā)展中國家,由于文化、經(jīng)濟(jì)因素的影響,癌前篩查并未完全普及。僅在我國,每年宮頸癌新發(fā)病例約15萬例,其中大約2萬女性死于宮頸癌。盡管目前研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌的預(yù)后與多種因素有關(guān),但迄今為止還未有客觀的預(yù)后指標(biāo)。目前分子生物學(xué)研究已經(jīng)確認(rèn),宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與人乳頭瘤病毒(HPV)的感染密切相關(guān)。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種無包膜的雙鏈DNA病毒,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100多種亞型,根據(jù)引起病變的良惡性程度可以分為低危型HPV和高危型HPV兩類。低危型HPV病毒主要引起皮膚粘膜等組織的良性病變,而高危型HPV病毒的長期感染與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。特別是HPV16、18型病毒,兩者在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率高達(dá)60%。高危型HPV病毒的長期感染使病毒基因組片段整合到宿主細(xì)胞的基因組中,并且在整合狀態(tài)下持續(xù)高表達(dá)病毒癌蛋白E6、E7。而E6、E7癌蛋白是參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要因素,它們可以分別抑制P53和降解pRb,通過改變宿主細(xì)胞內(nèi)一系列分子信號通路并與之相互作用,最終使宿主細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。然而,僅有HPV E6、E7的過表達(dá)并不能介導(dǎo)宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,HPV感染只是宮頸癌發(fā)生的首要啟動因子,HPV致宮頸癌的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。蛋白磷酸酶2A(Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A)的癌性抑制因子(CIP2A)是2007年新發(fā)現(xiàn)的一種癌蛋白,它是PP2A的內(nèi)源性抑制因子,可以通過PP2A抑制細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白S62位點(diǎn)的去磷酸化作用,從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白的含量�，F(xiàn)已證實,CIP2A在胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中都高表達(dá)。這提示CIP2A在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色,但其致癌機(jī)制尚不清楚。2011年,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：CIP2A在宮頸癌組織中高表達(dá),CIP2A可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和軟瓊脂克隆形成能力。且宮頸癌組織芯片中的免疫組化染色結(jié)果顯示：HPV E7與CIP2A的表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性。然而,宮頸癌中HPV E7是否可以調(diào)控CIP2A?如果可以,它通過何種機(jī)制調(diào)控CIP2A? CIP2A及相關(guān)因子是否有望作為評估宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因素?這些問題尚不清楚,也是本課題著力解決的科學(xué)問題。研究目的研究宮頸癌中HPV E7通過何種機(jī)制調(diào)控蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A),并進(jìn)一步探討基于此調(diào)控軸的相關(guān)蛋白對宮頸癌患者預(yù)后的指導(dǎo)意義。研究方法(1)利用小干擾RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法敲低宮頸癌細(xì)胞HeLa、 SiHa中HPV E7的表達(dá),實時熒光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot的方法檢測干擾E7后是否伴隨CIP2A表達(dá)水平的下降；培養(yǎng)PHK及多種PHK-E7細(xì)胞,RT-qPCR及Western blot的方法對比其中CIP2A的表達(dá)水平,確認(rèn)E7過表達(dá)是否伴隨CIP2A表達(dá)的升高；確認(rèn)E7與CIP2A的相互調(diào)控關(guān)系； (2)利用前期構(gòu)建的野生型和突變型E7的PHK細(xì)胞,對比E7失去pRb結(jié)合位點(diǎn)后是否仍然具有調(diào)控CIP2A表達(dá)的能力,揭示E7是否通過pRb依賴性途徑調(diào)控CIP2A;(3)通過大量的文獻(xiàn)閱讀和生物學(xué)軟件預(yù)測,查找出CIP2A啟動子區(qū)域可能被HPV E7調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子；運(yùn)用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa中篩選出最可能的轉(zhuǎn)錄因子X； (4)利用小干擾RNA及質(zhì)粒過表達(dá)技術(shù)改變宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa由HPV E7、CIP2A、轉(zhuǎn)錄因子X的表達(dá),運(yùn)用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot的方法檢測三者在RNA水平和蛋白的差異性表達(dá),揭示三者之間的相互調(diào)控關(guān)系；(5)利用免疫熒光技術(shù)檢測在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa細(xì)胞中CIP2A和轉(zhuǎn)錄因子X的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡下觀察兩者是否存在亞細(xì)胞共定位；(6)利用前期制備的宮頸癌組織芯片免疫組化方法檢測其中CIP2A和轉(zhuǎn)錄因子X的表達(dá),顯微鏡下觀察染色結(jié)果,SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。通過卡方檢驗揭示兩種蛋白的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系,通過KM生存分析、Cox單因素和多因素回歸模型,闡明兩種蛋白指導(dǎo)預(yù)后的價值。實驗結(jié)果(1)干擾HeLa和SiHa細(xì)胞中HPV E7可以顯著降低CIP2A的mRNA和蛋白水平的表達(dá),而對比PHK-E7與PHK細(xì)胞發(fā)現(xiàn),E7過表達(dá)后CIP2A的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),且高危型HPV E7對CIP2A的調(diào)控明顯強(qiáng)于低危型E7。因此,HPV E7可以上調(diào)CIP2A的表達(dá),且調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。(2)當(dāng)突變掉E7與pRb的結(jié)合位點(diǎn),即E7失去了降解pRb蛋白的能力后,E7對CIP2A的調(diào)控作用顯著降低,這提示E7對CIP2A的調(diào)控依賴于對pRb蛋白的降解；(3)通過大量的文獻(xiàn)閱讀和生物學(xué)軟件預(yù)測,我們鎖定了CIP2A啟動子區(qū)域可能被HPVE7調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子：E2F1、ETS1、Elkl。運(yùn)用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)在宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa中篩選出了最可能的轉(zhuǎn)錄因子E2F1。(4)通過干擾和過表達(dá)技術(shù),我們證實了宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa中HPV E7通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1上調(diào)CIP2A的轉(zhuǎn)錄和翻譯,而CIP2A可以反饋性調(diào)控E2F1的轉(zhuǎn)錄和翻譯,這提示E2F1和CIP2A之間存在相互調(diào)控的反饋環(huán)路,且調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。(5)利用免疫熒光染色及激光共聚焦技術(shù)揭示了宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa細(xì)胞中CIP2A和E2F1存在顯著的亞細(xì)胞共定位。(6)通過免疫組化染色及統(tǒng)計學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)：E2F1和CIP2A的表達(dá)具有顯著相關(guān)性；CIP2A和E2F1共表達(dá)的患者總體生存率和無病生存率顯著下降,CIP2A和E2F1共表達(dá)可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子指導(dǎo)宮頸癌患者的預(yù)后。結(jié)論(1)宮頸癌中HPV E7通過pRb依賴性途徑上調(diào)CIP2A的表達(dá),E7通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1上調(diào)CIP2A的表達(dá),而CIP2A可以反饋性上調(diào)E2F1的表達(dá)。因此,宮頸癌中E2F1及CIP2A之間存在正反饋環(huán)路。(2)宮頸癌組織中E2F1及CIP2A存在顯著的亞細(xì)胞共定位,兩者的共表達(dá)是評估宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。
【關(guān)鍵詞】：宮頸癌 HPV E7 CIP2A E2F1 預(yù)后
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 第一部分 HPV E7與CIP2A相互調(diào)控機(jī)制的初步研究14-38
• 前言14-16
• 材料與方法16-29
• 結(jié)果29-36
• 小結(jié)36-38
• 第二部分 CIP2A和E2F1在宮頸癌中對于預(yù)后指導(dǎo)意義的研究38-49
• 前言38-39
• 材料與方法39-41
• 結(jié)果41-48
• 小結(jié)48-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文目錄59-60
• 致謝60-61
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表61

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本文編號：653467