發(fā)布時(shí)間：2017-08-07 00:06

  本文關(guān)鍵詞：HPV分型環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)研究

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【摘要】：人乳頭瘤病毒(HPV)是一種DNA病毒,可以引起人類皮膚和粘膜的鱗狀增生,感染該病毒會出現(xiàn)尋常疣和生殖疣等癥狀。經(jīng)過多年的研究,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)高危人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是女性宮頸癌的主要誘因。由于HPV的分型較多,區(qū)分不同HPV亞型成了一個(gè)科研難點(diǎn)。因此,對HPV亞型尤其是高危亞型進(jìn)行分型研究,對于分子流行病學(xué)的預(yù)防、控制措施制定以及指導(dǎo)治療有著重要意義。目前,用于檢測HPV基因分型的技術(shù)和平臺眾多,基于基因序列的分子水平檢測技術(shù)是檢測HPV病毒分型的主要方法,其中使用最廣泛的是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。但由于該方法儀器昂貴并且耗時(shí)較長,因此不是最佳的檢測方法。本文根據(jù)HPV病毒基因的相關(guān)序列,選取該病毒基因中包含較大差異片段的L1區(qū),作為不同亞型的檢測目標(biāo)序列。構(gòu)建重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品,開展HPV DNA可視化LAMP檢測技術(shù)研究,區(qū)分其不同的亞型;并建立PCR-反向雜交與Taqman-qPCR檢測方法,用以比對驗(yàn)證研究。本文應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測25種不同亞型的HPV病毒,通過一系列反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化,建立LAMP反應(yīng)體系。由于反應(yīng)體系中加入了熒光染料——鈣黃綠素,據(jù)此可根據(jù)反應(yīng)前后的顏色是否發(fā)生變化來判斷反應(yīng)是否發(fā)生。添加了熒光染料的LAMP體系,可以通過肉眼的觀察,直接得出陽性或陰性的結(jié)果,而不借助變溫?zé)嵫h(huán)儀器�；谶@種效果,我們可將其作為可視化指示器。可視化LAMP體系的反應(yīng)溫度設(shè)為65℃,反應(yīng)時(shí)間定為60 min,不同亞型檢測限的平均水平可達(dá)到103拷貝數(shù)的數(shù)量級,并且亞型間不存在交叉反應(yīng)。這一技術(shù)應(yīng)用在450例臨床樣本上的符合率高達(dá)92.2%。本文將反向雜交方法作為一種對照的分子診斷方法。該方法作為分子診斷市場主流產(chǎn)品應(yīng)用的核心技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)多重同時(shí)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法的反應(yīng)時(shí)間為3h,不同亞型檢測限的平均水平也達(dá)到103拷貝數(shù)的數(shù)量級,并且亞型間不存在交叉反應(yīng)。使用同樣450例臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證,反向雜交技術(shù)的檢驗(yàn)符合率為98%。作為另一種對照技術(shù),qPCR方法在分子診斷領(lǐng)域被冠以產(chǎn)業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)。其檢測限達(dá)到101拷貝數(shù)數(shù)量級,特異性良好。與qPCR方法相比,LAMP技術(shù)的儀器依賴性較低,并且達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)要求的檢測限。與反向雜交技術(shù)相比,LAMP技術(shù)的操作相對簡便,反應(yīng)時(shí)間較短。此技術(shù)的應(yīng)用,將大大減少人力物力的前期投入,為基因水平的快速檢測,帶來新的思路。作為一種效率高、成本低、準(zhǔn)確度高的常規(guī)診斷工具,隨著LAMP技術(shù)應(yīng)用的日趨成熟,該技術(shù)在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用有著光明的前景。
【關(guān)鍵詞】：可視化LAMP 實(shí)時(shí) 快速檢測 HPV
【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33;R440
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-17
• 縮略詞匯總17-18
• 1 緒論18-33
• 1.1 宮頸癌及其檢測技術(shù)18-19
• 1.2 人乳頭瘤病毒19-20
• 1.2.1 病毒概述19
• 1.2.2 病毒的致病性19
• 1.2.3 病毒的分類19-20
• 1.3 人乳頭瘤病毒的檢測研究進(jìn)展20-21
• 1.3.1 基于細(xì)胞水平的檢測20-21
• 1.3.2 基于分子水平的檢測21
• 1.4 等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)21-28
• 1.4.1 LAMP技術(shù)方法概述21-22
• 1.4.2 LAMP技術(shù)反應(yīng)原理22-24
• 1.4.3 LAMP引物設(shè)計(jì)原則24-26
• 1.4.4 LAMP方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件26
• 1.4.5 LAMP反應(yīng)的結(jié)果判斷方法26
• 1.4.6 熒光指示劑鈣黃綠素26-27
• 1.4.7 LAMP方法擴(kuò)增核酸的優(yōu)點(diǎn)27-28
• 1.4.8 LAMP方法的應(yīng)用簡介28
• 1.5 反向雜交檢測技術(shù)28-30
• 1.5.1 反向雜交技術(shù)方法概述及基本特點(diǎn)28-29
• 1.5.2 反向雜交方法反應(yīng)原理29
• 1.5.6 反向雜交方法擴(kuò)增核酸的特點(diǎn)29
• 1.5.7 反向雜交方法的應(yīng)用簡介29-30
• 1.6 熒光定量PCR檢測技術(shù)30-32
• 1.6.1 熒光定量PCR技術(shù)方法概述及基本特點(diǎn)30
• 1.6.2 熒光定量PCR方法反應(yīng)原理30-31
• 1.6.3 熒光定量PCR方法擴(kuò)增核酸的特點(diǎn)31
• 1.6.4 熒光定量PCR方法的應(yīng)用簡介31-32
• 1.7 本論文研究內(nèi)容和意義32-33
• 1.7.1 本論文研究內(nèi)容32
• 1.7.2 本論文研究意義32-33
• 2 HPV標(biāo)準(zhǔn)品的制備與鑒定33-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要設(shè)備和儀器設(shè)備33-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 2.1.2 主要試劑34
• 2.1.3 儀器設(shè)備34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-42
• 2.2.1 病毒DNA的提取35-36
• 2.2.2 基因序列分析和型特異性引物設(shè)計(jì)36-38
• 2.2.3 感受態(tài)細(xì)胞DH5а 的制備38
• 2.2.4 病毒陽性質(zhì)粒的構(gòu)建38-40
• 2.2.5 菌液測序和序列分析40-41
• 2.2.6 重組質(zhì)粒的提取41
• 2.2.7 重組質(zhì)粒濃度及拷貝數(shù)的換算41-42
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-47
• 2.3.1 目的片段電泳鑒定結(jié)果42-45
• 2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測序鑒定45-47
• 2.4 小結(jié)與討論47-48
• 3 LAMP體系的建立48-71
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要設(shè)備和儀器設(shè)備48
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 3.1.2 主要試劑48
• 3.1.3 儀器設(shè)備48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法48-52
• 3.2.1 LAMP引物的設(shè)計(jì)48-52
• 3.2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件52
• 3.2.3 LAMP反應(yīng)的靈敏度實(shí)驗(yàn)操作52
• 3.2.4 LAMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn)操作52
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-71
• 3.3.1 LAMP體系的優(yōu)化52-55
• 3.3.2 LAMP方法的特異性55-68
• 3.3.3 LAMP方法的靈敏度68-71
• 3.4 小結(jié)與討論71
• 4 反向雜交體系的建立71-76
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要設(shè)備和儀器設(shè)備71-72
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料71
• 4.1.2 主要試劑71-72
• 4.1.3 儀器設(shè)備72
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法72-75
• 4.2.1 反向雜交方法的探針設(shè)計(jì)72-73
• 4.2.2 反向雜交方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件73-75
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75
• 4.3.1 反向雜交方法的特異性75
• 4.3.2 反向雜交方法的靈敏度75
• 4.3.3 反向雜交方法的臨床樣本檢測75
• 4.4 小結(jié)與討論75-76
• 5 熒光定量PCR體系的建立76-81
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要設(shè)備和儀器設(shè)備76
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料76
• 5.1.2 主要試劑76
• 5.1.3 儀器設(shè)備76
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法76-79
• 5.2.1 熒光定量PCR方法的Taqman探針設(shè)計(jì)76-78
• 5.2.2 熒光定量PCR方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件78-79
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-81
• 5.3.1 熒光定量PCR方法的特異性79
• 5.3.2 熒光定量PCR方法的靈敏度79-80
• 5.3.3 熒光定量PCR方法的臨床樣本檢測80-81
• 5.4 小結(jié)與討論81
• 6 HPV病毒臨床樣本檢測結(jié)果的比對分析81-83
• 7 總結(jié)、創(chuàng)新點(diǎn)與展望83-86
• 7.1 總結(jié)83-84
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)84-85
• 7.3 課題展望85-86
• 參考文獻(xiàn)86-90
• 附錄90-103
• 1、反向雜交體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-98
• 2、PCR-反向雜交方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果98-100
• 3、qPCR方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果100-103
• 作者簡歷103

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本文編號：631995