本文關(guān)鍵詞：miR-335在腫瘤組織中的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌增殖、轉(zhuǎn)移的影響

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【摘要】：腫瘤是一種世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病、多發(fā)病,腫瘤組織在細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)上,都與正常組織存在諸多差異。腫瘤致病因素主要有物理化學(xué)因素、病毒細(xì)菌因素、遺傳因素以及分子生物學(xué)因素。其中,分子生物學(xué)基礎(chǔ)與原癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)和凋亡調(diào)節(jié)基因、DNA修復(fù)基因功能的紊亂密切相關(guān)。本質(zhì)上腫瘤是一種基因疾病。microRNA (miRNA),又稱微小RNA,是真核生物中存在的一類保守的非編碼單鏈小RNA分子,長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸。它能與其靶標(biāo)mRNA配對(duì)互補(bǔ)作用于mRNA,使它降解或抑制其翻譯,從而發(fā)揮miRNA的調(diào)控基因表達(dá)作用。miRNA與生物體內(nèi)眾多生理功能有關(guān),細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程都受到miRNA的調(diào)控。近年來(lái), miRNA成為研究熱點(diǎn),并己建立了龐大的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,各種預(yù)測(cè)軟件或在線網(wǎng)站為尋找miRNA靶基因提供了一種方便快捷的預(yù)測(cè)方法�；蛐酒漠a(chǎn)生和應(yīng)用為基因功能研究帶來(lái)了全新的契機(jī),其高通量、快速、靈敏的特性大大提高了研究效率和準(zhǔn)確性,也提供了海量數(shù)據(jù)供研究人員挖掘開(kāi)發(fā)。隨著對(duì)miRNA的深入研究,miRNA表達(dá)譜芯片己成為高通量檢測(cè)分析不同細(xì)胞組織中的差異miRNA的重要工具,在腫瘤的miRNA研究中應(yīng)用廣泛。與基因芯片等大數(shù)據(jù)產(chǎn)生的同時(shí),DNA、RNA、miRNA以及蛋白等的數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)分析軟件也逐漸建立并完善起來(lái)。為基因的功能研究、網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析等提供了更多的信息,各種運(yùn)算方法的不斷改善也為生物信息學(xué)分析提高了準(zhǔn)確性和可信度。多個(gè)研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展與眾多miRNA調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)。miR-335也與卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤相關(guān),在不同腫瘤中扮演者癌基因或抑癌基因的角色。參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控,還與信號(hào)通路等基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)�；趍iR-335在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)具有一定的影響,因此我們推測(cè)miR-335在腫瘤的致病機(jī)制中占據(jù)重要作用。采用生物信息學(xué)方法分析miR-335序列保守性推測(cè)miR-335在物種進(jìn)化中的作用,結(jié)合miRNA的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)一步預(yù)測(cè)其調(diào)控靶基因,再針對(duì)靶基因集合分析基因可能參與的生物學(xué)功能和調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以期明確miR-335在腫瘤中的作用方向,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)深入研究提供一定的方向。根據(jù)生物信息學(xué)方法對(duì)miR-335的分析結(jié)果,我們最終選取數(shù)據(jù)集中較為特殊的宮頸癌作為研究目標(biāo)發(fā)展實(shí)驗(yàn)研究。宮頸癌是女性高發(fā)性癌癥,嚴(yán)重危害女性健康。在全球婦科病中是僅次于乳腺癌的第二高致死率癌癥,每年有超過(guò)50萬(wàn)婦女確診為宮頸癌,在發(fā)展中國(guó)家死亡率更是高達(dá)85%。在中國(guó),每年約有50,000婦女因患宮頸癌死亡。目前治療宮頸癌的方法主要是手術(shù)治療,放化療等傳統(tǒng)治療以及基因治療、靶向治療等新型方法。尋找治療靶基因仍然是預(yù)防、診斷宮頸癌的重要方向。為進(jìn)一步研究miR-335在宮頸癌中的作用,我們首先收集了宮頸癌患者宮頸癌組織及癌旁組織制成的石蠟切片,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-335在宮頸癌及癌旁組織石蠟切片中的表達(dá)量。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選取宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行,使用化學(xué)合成的miR-335模擬物以及抑制物miR-335 mimics和miR-335inhibitor及其對(duì)照組mimics NC和inhibitors NC轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞。miRNA模擬物能有效增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)miRNA的功能,而miRNA抑制物能有效抑制內(nèi)源性成熟miRNA功能,高效長(zhǎng)久的抑制miRNA活性,mimics NC和inhibitors NC采用21-23 nt 2’-甲氧修飾的RNA寡核酸設(shè)計(jì),可消除非序列特異性的作用效應(yīng),從而全面了解mimics或inhibitor以及背景效應(yīng)之間的異同。人為改變HeLa細(xì)胞miR-335表達(dá)水平后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增殖、周期、侵襲、遷移等多種生物學(xué)行為的檢測(cè),揭示miR-335在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。本課題的研究成果將為后期深入研究miR-335在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制提供新的方向和思路。并加深我們對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的了解,為尋找新的診斷、治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)提供新線索。方法：1.從miRNA分子數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase中查找miR-335在多個(gè)物種中的成熟序列,并進(jìn)行序列比對(duì)分析,根據(jù)各物種miR-335的堿基序列相似程度分析miR-335在物種中的保守性。2.從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GEO中檢索常見(jiàn)腫瘤疾病miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集,選擇包含腫瘤組織與癌旁組織分組并有miR-335表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集作為后續(xù)研究數(shù)據(jù)集。將數(shù)據(jù)集導(dǎo)入芯片數(shù)據(jù)分析軟件Qlucore Omics Explorer (QOE) 3.0,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,選擇適當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法篩選差異表達(dá)miRNA,并進(jìn)一步分析miR-335各腫瘤組織中的表達(dá)水平。3.分別在DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan等在線預(yù)測(cè)miR-335的靶基因,取各個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果交集。查詢miRTarBase及文獻(xiàn)報(bào)道中經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因,與預(yù)測(cè)靶基因取并集作為后續(xù)分析的miR-335靶基因集合。4.在線使用DAVID上傳miR-335靶基因集合,選擇人類全基因組為背景,對(duì)其靶基因集合進(jìn)行功能富集分析(GO-analysis)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG Pathway analysis)。5.在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)之上,選取宮頸癌為后期研究對(duì)象。首先搜集19組病理學(xué)確診為宮頸癌的患者宮頸癌組織及癌旁組織制成的石蠟切片,采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這19組宮頸癌及癌旁組織石蠟切片中miR-335表達(dá)量,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較miR-335在宮頸癌及其癌旁組織的表達(dá)水平差異。6.在得到miR-335在宮頸癌及其癌旁組織的表達(dá)水平差異后,結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,選取宮頸癌HeLa細(xì)胞作為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究miR-335宮頸癌HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。宮頸癌HeLa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-335模擬物miR-335 mimics和miR-335模擬物抑制物miR-335 inhibitor及其對(duì)照組mimics NC和inhibitors NC,達(dá)到上調(diào)或下調(diào)miR-335表達(dá)水平目的。同時(shí)使用FAM標(biāo)記的miRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞作為陰性對(duì)照組,初步觀察轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞中miR-335表達(dá)量變化進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。7. HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值變化,反映細(xì)胞的增值能力；通過(guò)細(xì)胞流式檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布變化。討論miR-335高表達(dá)或低表達(dá)后對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。8. HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲或遷移的細(xì)胞數(shù),反映細(xì)胞的侵襲和遷移能力；通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在24h,48h的遷移率,反映細(xì)胞的遷移能力。討論miR-335高表達(dá)或低表達(dá)后對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果：1.在miRBase中共查詢到大鼠、小鼠、家犬等12個(gè)物種中的成熟序列,通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在這12個(gè)物種中miR-335的堿基序列高度相似,說(shuō)明miR-335在物種間具有高度的保守性。2.根據(jù)檢索條件,從GEO中獲得了肝癌(GSE31383)、肺癌(GSE48414)、乳腺癌(GSE38167)、肝內(nèi)膽管癌(GSE53870)、脂肪肉瘤(GSE45364)、宮頸癌數(shù)據(jù)集(GSE303656)共6個(gè)符合要求的miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集。將數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Qlucore Omics Explorer (QOE) 3.0分析發(fā)現(xiàn),miR-335在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝內(nèi)膽管癌、脂肪肉瘤腫瘤組織中的表達(dá)均與癌旁組織存在表達(dá)差異,且表達(dá)水平均為下調(diào),差異倍數(shù)分別為0.32、0.07、0.19、0.93、0.58,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；miR-335在宮頸癌組織中亦存在表達(dá)差異,但表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì),差異倍數(shù)分別為1.10,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.使用DIANA-microT、PicTar、miRDB和TargetScan在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-335靶基因,所得靶基因數(shù)目分別為166、137、251和2308個(gè),這些靶基因取交集共有8個(gè)。在miRecords中查詢經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和PubMed相關(guān)文獻(xiàn)中經(jīng)證實(shí)的miR-335靶基因分別為15個(gè)、20個(gè)。三者結(jié)果取并集共有34個(gè)靶基因作為后續(xù)研究。4.對(duì)miR-335的34個(gè)靶基因集合做GO分析和KEGG分析,結(jié)果顯示,miR-335靶基因功能富集于細(xì)胞遷移、凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及蛋白分子連接、細(xì)胞骨架組成等生物學(xué)過(guò)程和分子功能(P0.05)；主要參與了軸突向?qū)Ш宛ぶ咝盘?hào)通路、黑素瘤疾病信號(hào)通路以及TGF-beta信號(hào)通路(P0.05)。5.在19組宮頸癌組織與癌旁組織石蠟切片的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,有17對(duì)組織中miR-335在宮頸癌組織中較癌旁組織中顯著低表達(dá),2組宮頸癌組織中的miR-335表達(dá)水平高于癌旁組織。miR-335在宮頸癌組織的表達(dá)水平均值顯著低于癌旁組織,差異倍數(shù)為0.287,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.169,P0.001)。6. HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miRNA 6h后于熒光倒置顯微鏡下觀察,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光,覆蓋率約為80%。進(jìn)一步采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-335 mimics和miR-335 inhibitor及其對(duì)照物mimicsNC和inhibitors NC后各組miR-335的表達(dá)水平。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-335mimics組表達(dá)量相對(duì)mimics NC組明顯升高,差異倍數(shù)180.046,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.825, P=0.004); miR-335 inhibitor轉(zhuǎn)染組表達(dá)量較inhibitor NC組表達(dá)量明顯降低,差異倍數(shù)0.458。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.292, P=0.030)。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-335 mimics和miR-335 inhibitor能有效提高或降低細(xì)胞內(nèi)miR-335表達(dá)水平。7.CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增值情況在分組和時(shí)間上均具有顯著性差異,且存在時(shí)間和分組交互效應(yīng)。上調(diào)HeLa細(xì)胞miR-335表達(dá)后從第2天起細(xì)胞增殖速度明顯降低(t=-10.252,P=0.001)；下調(diào)HeLa細(xì)胞miR-335表達(dá)則從第2天起細(xì)胞增殖速度明顯加快(t=22.396,P0.001)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明上調(diào)HeLa細(xì)胞miR-335表達(dá)后,細(xì)胞周期在G0/G1期所占百分明顯減少(t=-22.734,P=0.002),而在S期細(xì)胞所占百分明顯增加(t=6.707,P=0.003),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8. Transwell實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-335 mimics組的細(xì)胞穿膜數(shù)量均相比mimics NC組顯著減少(P0.05),而miR-335 inhibitor組細(xì)胞穿膜數(shù)量均相比inhibitor NC組顯著增多(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-335 mimics組的細(xì)胞在24h,48h細(xì)胞遷移率均顯著低于mimics NC組(P0.05),而miR-335 inhibitor組的細(xì)胞在24h,48h細(xì)胞遷移率均顯著高于inhibitor NC組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：miR-335序列在不同物種間具有高度保守性,其表達(dá)水平在肝癌、肺癌、乳腺癌、肝內(nèi)膽管癌、脂肪肉瘤等多種腫瘤中異常低表達(dá)。miR-335靶基因涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-335在宮頸癌組織中低表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可抑制HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、和遷移,細(xì)胞阻滯于S期；轉(zhuǎn)染miR-335 inhibitor可促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。
【關(guān)鍵詞】：miR-335 生物信息學(xué) 宮頸癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-22
• 第一章 miR-335在腫瘤組織中的表達(dá)及其預(yù)測(cè)靶基因的生物信息學(xué)分析22-36
• 1.1 材料與方法22-25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-31
• 1.3 討論31-36
• 第二章 miR-335對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)移的影響36-60
• 2.1 材料與方法36-45
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-55
• 2.3 討論55-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 英文縮略詞表68-71
• 攻讀學(xué)位期間成果71-72
• 致謝72-73

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本文編號(hào)：626404