本文關(guān)鍵詞：康普瑞汀磷酸鈉對孕鼠胚胎毒性和致畸性的初步研究

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【摘要】：癌癥是威脅人類健康、造成死亡的主要疾病之一。目前臨床上可通過手術(shù)切除腫瘤病灶、化療、放療等來治療癌癥,其中給予患者抗腫瘤藥物的化療方式是比較重要的治療方法。妊娠同時并發(fā)惡性腫瘤的幾率并不高,但隨著腫瘤發(fā)病年輕化、低齡化趨勢的出現(xiàn),臨床上妊娠合并惡性腫瘤的患者也在逐年增多。對于不適合手術(shù)的惡性腫瘤合并妊娠患者,當其不愿意終止妊娠、但腫瘤病情又不能推遲到分娩后再行治療時,選擇安全的化療藥物是可行的治療方法。但目前臨床上應(yīng)用的化療藥物中大部分是傳統(tǒng)的具有細胞毒性的藥物,機體易產(chǎn)生耐藥性,殺傷細胞時特異性不強,在破壞腫瘤細胞的同時會影響正常細胞的功能,顯然這類傳統(tǒng)的細胞毒性藥物不適用于妊娠合并惡性腫瘤的患者,因此研發(fā)新型細胞毒性藥物是目前各國研究人員關(guān)注的熱點問題。新型靶向細胞毒性藥物多具有從天然化產(chǎn)物(如植物、海洋生物等)中尋找的化學結(jié)構(gòu)和活性成分,能區(qū)分正常細胞和腫瘤細胞之間的差異,從而達到治療時高選擇性、低毒性的效果�？灯杖鹜×姿徕c(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)是Combretastatin A-4(CA-4)的磷酸鈉鹽形式,是一種尚未上市的新型細胞毒性藥物,主要與細胞內(nèi)的秋水仙堿位點結(jié)合來抑制細胞內(nèi)微管蛋白的聚合及細胞有絲分裂,使細胞停止增殖而殺傷腫瘤細胞,該藥物是微管蛋白抑制劑類抗腫瘤藥物的典型代表。傳統(tǒng)的微管蛋白類抑制劑需達到病人對該腫瘤藥物的最大耐受劑量附近時才能更好的發(fā)揮抗腫瘤作用,而CA-4只需最大耐受劑量的十分之一即可發(fā)揮其強大的抗腫瘤作用。它對多種腫瘤細胞具有細胞毒性,包括部分多重耐藥腫瘤細胞。但是由于CA-4的水溶性很差,經(jīng)血管給藥困難,故將其制成了磷酸鈉鹽形式(CA-4P),這極大地改善了CA-4的水溶性和藥代動力學性質(zhì)。由于磷酸脂酶在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中的濃度高于正常細胞,CA-4P進入體內(nèi)后使在腫瘤血管中被該酶選擇性激活,可靶向釋放出CA-4從而發(fā)揮抗血管、抗腫瘤的作用,是比較有前景的血管靶向劑。但是這個新型靶向藥物能否用于妊娠合并腫瘤患者的治療以及對妊娠母體和發(fā)育中的胎兒是否有毒性作用,尤其是致畸性如何尚未見明確報道。出生缺陷和先天畸形是常見并且后果嚴重的異常妊娠的結(jié)局,在給患兒本身及其家庭帶來身心痛苦和經(jīng)濟壓力的同時,也會增加社會負擔,而妊娠期間的不合理用藥是導致出生缺陷和先天畸形的主要因素之一。本研究選用妊娠SD大鼠作為實驗動物,在其致畸敏感期給藥,初步探討該藥對孕鼠有無胚胎毒性及致畸毒性,并探索其安全治療給藥窗,為臨床上該藥對妊娠合并惡性腫瘤患者的治療及合理用藥提供參考依據(jù)。第一部分康普瑞汀磷酸鈉對孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究目的:觀察康普瑞汀磷酸鈉(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)對SD孕鼠的胚胎毒性及致畸作用。方法:實驗時將性成熟SD雄鼠及雌鼠按1:1合籠交配,次日晨8點檢查雌鼠陰道有無乳白色陰栓來判斷交配是否成功,以查見陰栓當日記為受孕的第0日(GD0)。將交配成功的雌鼠隨機分為低、中、高劑量實驗組及溶媒對照組,每組20只。于妊娠第6~15日經(jīng)尾靜脈注射分別給予CA4P 0.15mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg(分別是臨床等效劑量的1倍、3倍,10倍),溶媒對照組經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水,給藥容積均為10ml/kg,每日1次。給藥期間觀察孕鼠一般情況,并在妊娠第0、6、15、20日稱量孕鼠體重;妊娠第20日處死孕鼠,檢查孕鼠妊娠及胎鼠畸形情況,并逐個稱量子宮連胎重量、子宮重量、胎盤重量及活胎重量,統(tǒng)計卵巢黃體、吸收胎、死胎及活胎數(shù)目,計算胚胎著床率、活胎率、吸收胎率、死胎率;逐個測量活胎頂臀長度,鑒定胎鼠性別。大致觀察胎鼠外觀畸形情況后將每窩胎鼠的一半放于Bouin氏液中,固定2周后取出,采用Wilsons切片法對胎鼠的頭部進行檢查,觀察口、眼、鼻、腦室等有無發(fā)育畸形;剪開胎鼠的胸腹腔,逐步檢查心、肝、脾、肺、腎的位置、數(shù)目、大小及形狀等;將每窩胎仔的另一半用95%乙醇溶液浸泡固定2周后,用茜紅素應(yīng)用液染色,再經(jīng)三種不同濃度甘油溶液透明后在解剖顯微鏡下檢查骨骼畸形情況。結(jié)果:與溶媒對照組相比,0.15mg/kg劑量組孕鼠及胎鼠未見明顯毒性表現(xiàn),差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);0.50mg/kg劑量對孕鼠未見明顯毒性反應(yīng),但對活胎體重、胎盤重量、活胎頂臀長以及尾椎骨書、掌骨數(shù)、枕骨數(shù)、胸骨數(shù)有明顯影響,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);1.50mg/kg劑量對孕鼠體重增長、胚胎著床率、吸收胎率、活胎率、活胎體重、活胎頂臀長、胎盤重量以及尾椎數(shù)、掌骨數(shù)、枕骨數(shù)、胸骨數(shù)均有影響,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。各劑量組胎鼠未見明顯的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等重要臟器畸形及外觀畸形。結(jié)論:本實驗條件下,CA4P對親代孕鼠以及胚胎、胎仔發(fā)育未觀察到不良反應(yīng)的劑量水平分別為0.50mg/kg和0.15mg/kg,對胎仔未觀察到致畸作用的劑量水平是1.50mg/kg。第二部分康普瑞汀磷酸鈉胚胎毒性的機制初探目的:初步探討康普瑞汀磷酸鈉(CA4P)是否影響了母胎界面Th1、Th2細胞因子平衡從而導致孕鼠吸收胎增多。方法:將交配成功的雌鼠隨機分為低、高劑量實驗組及溶媒對照組,每組12只,于妊娠第6~14日經(jīng)尾靜脈注射分別給予CA4P 1mg/kg、3mg/kg體重,溶媒對照組經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水,給藥容積為10ml/kg,每日1次。妊娠第14日處死低、高劑量組及溶媒對照組孕鼠各6只,余下每組孕鼠于妊娠第20日處死;鈍性剝離孕鼠胎盤及子宮蛻膜組織,經(jīng)酶消化、洗滌、離心后取原代細胞;調(diào)整細胞數(shù)為5×106個/ml接種在24孔板中,并放置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行原代細胞共培養(yǎng);24小時后收集細胞上清,用Elisa酶聯(lián)免疫法檢測細胞上清中IFN-γ、IL-10、IL-4的量,并計算不同劑量組、不同孕期母胎界面細胞上清中Th1/Th2(IFN-γ/IL-10)細胞因子比值。結(jié)果:與溶媒對照組相比,1mg/kg的給藥劑量對孕鼠整個孕期的母胎界面IFN-γ、IL-10的分泌量無明顯影響,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);Th1/Th2平衡無明顯偏移趨勢(P0.05);當給藥劑量為3mg/kg時,孕鼠不同孕期母胎界面的IFN-γ表達量未見明顯差異;但IL-10的分泌量隨給藥劑量的增高而明顯降低,與對照組比較差異明顯,有統(tǒng)計學意義(p0.001);妊娠第14日時,高劑量組Th1/Th2平衡明顯Th1方向偏移,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01);妊娠第20日時,高劑量組母胎界面Th1/Th2細胞因子平衡明顯向Th1方向漂移,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:在本實驗條件下,CA4P不影響母胎界面IFN-γ的分泌量;高劑量時可使母胎界面IL-10分泌量降低,導致Th1/Th2細胞因子平衡向Th1方向移動,而影響妊娠的維持。全文總結(jié):1、本實驗條件下,CA4P對親代孕鼠以及胚胎、胎仔發(fā)育未觀察到不良反應(yīng)的劑量水平分別為0.50mg/kg和0.15mg/kg,對胎仔未觀察到致畸作用的劑量水平是1.50mg/kg。該藥在用于妊娠合并惡性腫瘤患者時,若超過安全劑量則有導致胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩、甚至胎死宮內(nèi)可能,可能有潛在的致畸性。2、CA4P引起妊娠胚胎丟失的原因很多,但從免疫學角度看,該藥在體內(nèi)超過一定劑量時可導致母胎界面Th1/Th2平衡向Th1方向漂移,從而導致妊娠的終止,吸收胎增多。由于目前對CA4P的相關(guān)研究較少,至于它是直接通過細胞毒作用損傷了母胎界面分泌Th1、Th2型的免疫細胞及滋養(yǎng)細胞,導致了平衡偏移,還是像傳統(tǒng)化療藥物一樣影響了機體全身免疫反應(yīng),從而導致母胎界面Th1/Th2平衡被動的偏移機制尚不清楚,仍待進一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：CA4P 大鼠 胚胎毒性 致畸性 吸收胎 Th1、Th2細胞因子 IFN-γ IL-10
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.2
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文縮略詞表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 康普瑞汀磷酸鈉對孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究17-31
• 一、材料與方法17-21
• 二、實驗結(jié)果21-27
• 三、討論27-30
• 四、小結(jié)30-31
• 第二部分 康普瑞汀磷酸鈉胚胎毒性機制的初步探討31-40
• 一、材料與方法32-35
• 二、實驗結(jié)果35-37
• 三、討論37-39
• 四、小結(jié)39-40
• 全文總結(jié)40-41
• 參考文獻41-46
• 綜述 妊娠合并婦科惡性腫瘤的治療進展46-58
• 參考文獻53-58
• 攻讀學位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明58-59
• 致謝59

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本文編號：568658