本文關(guān)鍵詞：GnRHa對SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

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【摘要】：目的:體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)中,優(yōu)質(zhì)的胚胎、接受態(tài)子宮內(nèi)膜和胚胎與內(nèi)膜發(fā)育的同步發(fā)育是胚胎成功種植的關(guān)鍵。凍融胚胎移植周期中,在胚胎質(zhì)量一定的情況下,改善子宮內(nèi)膜容受性,能改善胚胎種植結(jié)局。目前常用的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案主要有自然周期、誘導(dǎo)排卵周期及激素替代周期。近年來的研究提示,促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone,Gn RH)不僅合成于中樞神經(jīng)系統(tǒng),通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPO)作用于卵巢及子宮,在卵巢、子宮等外周生殖系統(tǒng)也有合成,促性腺激素釋放激素受體(gonadotrophin releasing hormone,Gn RHR)在卵巢顆粒細(xì)胞及子宮上皮和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)也很豐富,其在子宮內(nèi)膜的表達(dá)在黃體期升高,Gn RH可能從多個層面調(diào)節(jié)生殖活動,改善子宮內(nèi)膜容受性。子宮內(nèi)膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用,白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物之一,胞飲突被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性經(jīng)典的形態(tài)學(xué)標(biāo)志,它們的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜的“種植窗期”相吻合,子宮內(nèi)膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用雌(E)、孕激素(P)及促性腺激素釋放激素激動劑(Gn RHa)建立SD大鼠(Spparague-Dawley rats)子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案模型。分析各方案中大鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目、腺體總面積、LIF表達(dá)水平及胞飲突的表達(dá),研究Gn RHa對SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法:1 SD大鼠一般狀況評估自入組開始,密切觀察大鼠活動情況,有無活動增多、躁動、進(jìn)食量減少等低雌激素癥狀。每4天稱量大鼠體重,分析大鼠體重變化,計算大鼠進(jìn)食量。2不同方案內(nèi)膜準(zhǔn)備方法SD大鼠模型的建立實驗動物為雌性未孕SD大鼠,每日上午9:00行陰道細(xì)胞涂片檢查確定大鼠生殖周期,超聲檢測大鼠子宮內(nèi)膜厚度,連續(xù)觀察2周期。選60只有正常生殖周期的大鼠,隨機(jī)分為四組,自然周期組(nature cycle group,NC group)、人工周期組(hormone replacement therapy group,HRT group)、高劑量Gn RHa降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組(high-dose Gn RHa and hormone replacement therapy group,HDG-HRT group)、低劑量Gn RHa降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組(low-dose Gn RHa and hormone replacement therapy group,LDG-HRT group),每組15只,各組大鼠周齡及體重?zé)o差別。自然周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2m L,28天后查陰道細(xì)胞涂片,動情期與雄鼠合籠,次晨檢出現(xiàn)陰道栓或者記為孕0天;人工周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2m L,28天后每日給予補(bǔ)佳樂0.42mg/kg灌胃,超聲監(jiān)測大鼠子宮內(nèi)膜厚度,達(dá)到自然周期中動情期大鼠子宮內(nèi)膜厚度的平均值2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時與成年雄鼠合籠,次晨檢測到陰道栓者記為孕0天,同時加用黃體酮6mg/kg肌注;高劑量降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組、低劑量降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期組于動情間期給予達(dá)菲林0.4mg/kg、0.2mg/kg肌肉注射,給藥28天開始給予補(bǔ)佳樂0.42mg/kg灌胃,超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度,根據(jù)內(nèi)膜厚度及陰道細(xì)胞學(xué)涂片情況調(diào)節(jié)補(bǔ)佳樂用藥時間,內(nèi)膜厚度達(dá)到自然周期中動情期大鼠子宮內(nèi)膜厚度的平均值2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時加用黃體酮6mg/kg肌注,并與雄鼠交配,晨起檢出陰道栓者記孕0天,各組大鼠均于孕4天處死大鼠并取子宮。3不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度的超聲測量運(yùn)用Philips IU 22多普勒超聲儀檢測大鼠子宮內(nèi)膜厚度,使用30MHZ高頻電子線陣探頭進(jìn)行檢測,測量雙側(cè)子宮內(nèi)膜最厚的位置的厚度,并取平均值。超聲檢查大鼠子宮內(nèi)膜厚度的時機(jī)為:分組前確定大鼠生殖周期時同時測量生殖各周期大鼠子宮內(nèi)膜厚度;NC組大鼠檢測動情間期、動情期子宮內(nèi)膜厚度;HRT組自動情間期開始給補(bǔ)佳樂時監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度,直至達(dá)到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時給予黃體酮,HDG-HRT組、LDG-HRT組降調(diào)節(jié)0、7、14、21、28天測量大鼠子宮內(nèi)膜厚度,給補(bǔ)佳樂后每日監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度,直至達(dá)到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。4 SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)的分析方法首先,取各內(nèi)膜準(zhǔn)備方案組中SD大鼠子宮,進(jìn)行HE染色,從低倍至高倍鏡觀察各組大鼠子宮內(nèi)膜在光鏡下的組織學(xué)形態(tài),計數(shù)各組大鼠子宮橫斷面中腺體的數(shù)目。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)分析各個標(biāo)本橫斷面腺體的總面積。其次,用免疫組化SP法定位大鼠子宮內(nèi)膜LIF定位并進(jìn)行半定量分析,每份標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野,記錄腔上皮及腺上皮細(xì)胞染色強(qiáng)度及各強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)所占百分比,并用免疫組織化學(xué)評分法H-score法對LIF表達(dá)量進(jìn)行半定量分析,計算公式為?i Pi(10))1(,Pi為陽性細(xì)胞百分率,i為染色強(qiáng)度,以每張切片染色底背景作為對照,不顯色或顯色不清為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;深褐色為3分。第三,用S-3500N掃描電鏡觀察大鼠子宮胞飲突表達(dá)情況并用胞飲突評分法分析大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)量的差異,具體為:掃描電鏡下,放大3500倍,視野下可觀察到的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞數(shù)量為250個,每個標(biāo)本隨機(jī)選取50個視野,50個視野內(nèi)胞飲突的表達(dá)數(shù)量作為胞飲突評分,計算各組大鼠胞飲突評分均值;5統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊性檢驗,三組以上采用方差分析,組間差異采用LSD法,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,以α0.05為檢驗水準(zhǔn),當(dāng)P0.05時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;當(dāng)P0.05時,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1各組SD大鼠一般狀況評估降調(diào)節(jié)第5天開始,HDG-HRT及LDG-HRT組大鼠出現(xiàn)躁動,進(jìn)食量減少等低雌激素癥狀,毛色晦暗;降調(diào)第14天,HDG-HRT及LDG-HRT組與自然周期組相比,進(jìn)食量減少,但無顯著區(qū)別(P=0.100,P=0.120),體重略下降,無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.140,P=0.130)。給予雌激素后,降調(diào)節(jié)組大鼠進(jìn)食量增加,體重逐漸上升,低雌激素癥狀消失。處死前,各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P=0.100),進(jìn)食量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.100)。2 SD大鼠陰道細(xì)胞涂片結(jié)果自然周期中大鼠陰道細(xì)胞涂片呈周期性變化,約4天一周期,依次為動情前期,動情期,動情后期,動情間期。動情前期,持續(xù)約9-18小時,陰道涂片上全部為有核上皮,偶見少量角化細(xì)胞;動情期,持續(xù)約1天,陰道涂片顯示全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞;動情后期,持續(xù)約10-14小時,此期陰道涂片顯示為白細(xì)胞、角化細(xì)胞及有核上皮均有;動情間期,持續(xù)約2-2.5天,此期陰道涂片顯示為大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和黏液。HRT組大鼠雌激素給藥后,陰道涂片細(xì)胞逐漸變化,無核上皮逐漸增多,直至全部為無核上皮。HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠降調(diào)節(jié)5天后陰道涂片細(xì)胞去周期變化,表現(xiàn)為大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和黏液,給予雌激素灌胃給藥后逐漸轉(zhuǎn)變有核上皮至全部變?yōu)闊o核上皮。綜上所述,給予雌激素后,HRT組、HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠陰道細(xì)胞涂片逐漸變化,角化上皮逐漸增多直至全部變?yōu)榻腔掀?與動情期陰道細(xì)胞學(xué)涂片表現(xiàn)一致。3超聲下SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度3.1自然周期SD大鼠生殖周期各期子宮內(nèi)膜厚度自然周期中大鼠動情周期次序為:動情前期、動情期、動情后期、動情間期,內(nèi)膜厚度隨動情周期呈周期性變化,分別為2.76±0.08mm,2.82±0.10mm,2.78±0.09mm,2.70±0.07mm。動情期子宮內(nèi)膜比動情前期、動情后期、動情間期厚(P=0.000,P=0.009,P=0.000)。動情間期子宮內(nèi)膜最薄,與動情前期相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.100);動情后期子宮內(nèi)膜厚度大于動情間期(P=0.000)。動情前期與動情后期相比,無顯著差異(P=0.160)。3.2各內(nèi)膜準(zhǔn)備方案中大鼠子宮內(nèi)膜厚度3.2.1降調(diào)節(jié)組SD大鼠子宮內(nèi)膜變化降調(diào)節(jié)第1至28天,HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠子宮內(nèi)膜逐漸變薄,給藥第7天,兩組大鼠內(nèi)膜厚度與對照組相比,HDG-HRT組內(nèi)膜厚度低于LDG-HRT組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.28±0.05mm,1.53±0.1mm,P=0.000)。降調(diào)節(jié)第14天、21天、28天,兩組內(nèi)膜厚度相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.120,P=0.051,P=0.105)。3.2.2各組SD大鼠用藥情況NC組大鼠沒有使用外源性激素,HRT組大鼠沒有使用降調(diào)節(jié)藥物。以內(nèi)膜厚度達(dá)到大鼠自然周期動情期子宮內(nèi)膜平均厚度2.82mm、陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細(xì)胞時為觀察日,各組大鼠雌激素用藥時間進(jìn)行比較,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素用藥天數(shù)分別為4天,10.9天,9.9天,HRT組短于HDG-HRT組和LDG-HRT組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000,P=0.000),HDG-HRT組比LDG-HRT組用藥時間長,但無明顯差別(P=0.068);HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素累計用藥量分別為1.68mg,4.59mg,4.14mg,HRT組顯著低于HDG-HRT組和LDG-HRT組(P=0.000,P=0.000),HDG-HRT組明顯高于LDG-HRT組(P=0.048)。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組黃體酮使用天數(shù)及劑量相同。3.2.3內(nèi)膜轉(zhuǎn)化期各組SD大鼠子宮內(nèi)膜厚度NC組大鼠動情期子宮內(nèi)膜厚度為2.81±0.16mm,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組加用黃體酮日各組子宮內(nèi)膜厚度依次為2.83±0.2mm,2.83±0.3mm,2.83±0.4mm,各組子宮內(nèi)膜厚度比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.110)。4 SD大鼠子宮內(nèi)膜容受性指標(biāo)結(jié)果4.1光鏡下各組SD大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)比較NC組大鼠腺體數(shù)目為9.7±1.6,腺體面積為1870.07±162.93μm2,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組腺體數(shù)目分別為9.8±1.5,11.1±1.7,10.8±1.4,腺體面積為1834.87±154.07μm2,2078.76±161.16μm2,2010.88±178.99μm2。HRT組與NC組腺體數(shù)目及面積均無顯著差異(P=0.814,P=0.560);HDG-HRT組和LDG-HRT組與NC組相比,腺體數(shù)目(P=0.016,P=0.049)及腺體面積(P=0.001,P=0.000)均明顯增大;HDG-HRT組和LDG-HRT組與HRT組相比,腺體數(shù)目增多(P=0.028,P=0.041),腺體面積增大(P=0.000,P=0.000);HDG-HRT組與LDG-HRT組之間相比,腺體數(shù)目及腺體面積均無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.638,P=0.600)綜合以上數(shù)據(jù)及光鏡下觀察子宮內(nèi)膜形態(tài),HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組及HRT組相比,腺體數(shù)目更多,形態(tài)不規(guī)則,腺體分泌空泡明顯,腺腔分泌物更多,間質(zhì)疏松水腫更加明顯。4.2 SD大鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)情況NC組大鼠種植窗期LIF組織學(xué)評分為2.59±0.38,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組大鼠子宮內(nèi)膜LIF組織學(xué)評分分別為2.58±0.24,2.70±0.42,2.72±0.65,HRT組LIF表達(dá)量略低于NC組,但兩組表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.657)。HDG-HRT組LIF表達(dá)量較LDG-HRT組高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.460)。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達(dá)量顯著高于NC組(P=0.000,P=0.000)。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達(dá)量顯著高于HRT組(P=0.000,P=0.000)4.3 SD大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突形態(tài)NC組為發(fā)育完全的胞飲突,表達(dá)明顯,發(fā)育同步,大小一致,表面光滑,其余內(nèi)膜表面被短小的微絨毛覆蓋。HRT組胞飲突為發(fā)育中的胞飲突,發(fā)育不同步,大小不一致,表面不甚光滑,余內(nèi)膜面可見濃密的微絨毛覆蓋。HDG-HRT組為發(fā)育完全的胞飲突,表達(dá)明顯,大小一致,發(fā)育同步,形態(tài)飽滿,表面光滑,微絨毛短小。LDG-HRT組胞飲突表達(dá)明顯,發(fā)育同步,大小一致,為發(fā)育完全的胞飲突,形態(tài)飽滿,表面較為光滑,余內(nèi)膜面微絨毛短小。綜上所述,HRT組與NC組相比,胞飲突大小不一致,表面不夠光滑;經(jīng)Gn RHa預(yù)處理的HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組相比,胞飲突發(fā)育完善,形態(tài)更加飽滿,微絨毛短小。4.4 SD大鼠子宮內(nèi)膜胞飲突評分NC組胞飲突評分為674.8±27.2。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組胞飲突評分分別為666.9±27.5,708.4±30.3,716.7±31.4。各組間相比,HRT組與NC之間相比,胞飲突評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.459);HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分顯著高于NC組(P=0.003,P=0.000);HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分高于HRT組(P=0.000,P=0.000);HDG-HRT組與LDG-HRT組相比,胞飲突評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.440)。結(jié)論:1利用促性腺激素釋放激素、雌激素、黃體酮成功建立大鼠子宮內(nèi)膜人工周期模型、降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期模型。2 HDG-HRT組與LDG-HRT組在光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)、電鏡下胞飲突形態(tài)均優(yōu)于NC組及HRT組,子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目及面積、LIF表達(dá)量、胞飲突評分高于NC組和HRT組,提示Gn RHa能改善子宮內(nèi)膜容受性。3在降調(diào)節(jié)聯(lián)合人工周期準(zhǔn)備方案中,低劑量Gn RHa即可達(dá)到高劑量Gn RHa相同的降調(diào)效果,提示臨床中可根據(jù)實際情況調(diào)整用量。
【關(guān)鍵詞】：垂體降調(diào)節(jié) 人工周期 SD大鼠 子宮內(nèi)膜容受性 白血病抑制因子 胞飲突
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-11
• 英文摘要11-18
• 英文縮寫18-19
• 前言19-21
• 材料與方法21-27
• 結(jié)果27-31
• 附圖31-38
• 附表38-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 綜述 最具預(yù)測價值的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物52-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 個人簡歷64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭文宇;劉燦燦;董藝丹;張小旭;張秀文;孫鳳芹;王逸舒;夏雷;;中藥對去勢小鼠生殖系統(tǒng)及行為學(xué)的影響[J];江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2015年01期

2 阮恒超,黃荷鳳,金帆;不同方案超排卵下小鼠子宮內(nèi)膜種植窗期整合素β3的表達(dá)[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年10期

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本文編號：550840