本文關鍵詞：GnRHa對SD大鼠子宮內膜容受性的影響

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【摘要】：目的:體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)中,優(yōu)質的胚胎、接受態(tài)子宮內膜和胚胎與內膜發(fā)育的同步發(fā)育是胚胎成功種植的關鍵。凍融胚胎移植周期中,在胚胎質量一定的情況下,改善子宮內膜容受性,能改善胚胎種植結局。目前常用的子宮內膜準備方案主要有自然周期、誘導排卵周期及激素替代周期。近年來的研究提示,促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone,Gn RH)不僅合成于中樞神經系統,通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPO)作用于卵巢及子宮,在卵巢、子宮等外周生殖系統也有合成,促性腺激素釋放激素受體(gonadotrophin releasing hormone,Gn RHR)在卵巢顆粒細胞及子宮上皮和基質細胞表達也很豐富,其在子宮內膜的表達在黃體期升高,Gn RH可能從多個層面調節(jié)生殖活動,改善子宮內膜容受性。子宮內膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用,白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是目前公認的子宮內膜容受性的標志物之一,胞飲突被認為是子宮內膜容受性經典的形態(tài)學標志,它們的出現與子宮內膜的“種植窗期”相吻合,子宮內膜腺體在胚胎種植過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用雌(E)、孕激素(P)及促性腺激素釋放激素激動劑(Gn RHa)建立SD大鼠(Spparague-Dawley rats)子宮內膜準備方案模型。分析各方案中大鼠子宮內膜腺體數目、腺體總面積、LIF表達水平及胞飲突的表達,研究Gn RHa對SD大鼠子宮內膜容受性的影響。方法:1 SD大鼠一般狀況評估自入組開始,密切觀察大鼠活動情況,有無活動增多、躁動、進食量減少等低雌激素癥狀。每4天稱量大鼠體重,分析大鼠體重變化,計算大鼠進食量。2不同方案內膜準備方法SD大鼠模型的建立實驗動物為雌性未孕SD大鼠,每日上午9:00行陰道細胞涂片檢查確定大鼠生殖周期,超聲檢測大鼠子宮內膜厚度,連續(xù)觀察2周期。選60只有正常生殖周期的大鼠,隨機分為四組,自然周期組(nature cycle group,NC group)、人工周期組(hormone replacement therapy group,HRT group)、高劑量Gn RHa降調節(jié)聯合人工周期組(high-dose Gn RHa and hormone replacement therapy group,HDG-HRT group)、低劑量Gn RHa降調節(jié)聯合人工周期組(low-dose Gn RHa and hormone replacement therapy group,LDG-HRT group),每組15只,各組大鼠周齡及體重無差別。自然周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2m L,28天后查陰道細胞涂片,動情期與雄鼠合籠,次晨檢出現陰道栓或者記為孕0天;人工周期組大鼠肌肉注射無菌注射用水0.2m L,28天后每日給予補佳樂0.42mg/kg灌胃,超聲監(jiān)測大鼠子宮內膜厚度,達到自然周期中動情期大鼠子宮內膜厚度的平均值2.82mm、陰道細胞涂片表現為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時與成年雄鼠合籠,次晨檢測到陰道栓者記為孕0天,同時加用黃體酮6mg/kg肌注;高劑量降調節(jié)聯合人工周期組、低劑量降調節(jié)聯合人工周期組于動情間期給予達菲林0.4mg/kg、0.2mg/kg肌肉注射,給藥28天開始給予補佳樂0.42mg/kg灌胃,超聲監(jiān)測子宮內膜厚度,根據內膜厚度及陰道細胞學涂片情況調節(jié)補佳樂用藥時間,內膜厚度達到自然周期中動情期大鼠子宮內膜厚度的平均值2.82mm、陰道細胞涂片表現為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時加用黃體酮6mg/kg肌注,并與雄鼠交配,晨起檢出陰道栓者記孕0天,各組大鼠均于孕4天處死大鼠并取子宮。3不同內膜準備方案SD大鼠子宮內膜厚度的超聲測量運用Philips IU 22多普勒超聲儀檢測大鼠子宮內膜厚度,使用30MHZ高頻電子線陣探頭進行檢測,測量雙側子宮內膜最厚的位置的厚度,并取平均值。超聲檢查大鼠子宮內膜厚度的時機為:分組前確定大鼠生殖周期時同時測量生殖各周期大鼠子宮內膜厚度;NC組大鼠檢測動情間期、動情期子宮內膜厚度;HRT組自動情間期開始給補佳樂時監(jiān)測子宮內膜厚度,直至達到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細胞涂片表現為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時給予黃體酮,HDG-HRT組、LDG-HRT組降調節(jié)0、7、14、21、28天測量大鼠子宮內膜厚度,給補佳樂后每日監(jiān)測子宮內膜厚度,直至達到自然周期動情期水平2.82mm、陰道細胞涂片表現為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時給予黃體酮轉化內膜。4 SD大鼠子宮內膜容受性指標的分析方法首先,取各內膜準備方案組中SD大鼠子宮,進行HE染色,從低倍至高倍鏡觀察各組大鼠子宮內膜在光鏡下的組織學形態(tài),計數各組大鼠子宮橫斷面中腺體的數目。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(武漢千屏影像技術有限責任公司)分析各個標本橫斷面腺體的總面積。其次,用免疫組化SP法定位大鼠子宮內膜LIF定位并進行半定量分析,每份標本隨機選取5個視野,記錄腔上皮及腺上皮細胞染色強度及各強度細胞數所占百分比,并用免疫組織化學評分法H-score法對LIF表達量進行半定量分析,計算公式為?i Pi(10))1(,Pi為陽性細胞百分率,i為染色強度,以每張切片染色底背景作為對照,不顯色或顯色不清為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;深褐色為3分。第三,用S-3500N掃描電鏡觀察大鼠子宮胞飲突表達情況并用胞飲突評分法分析大鼠子宮內膜胞飲突表達量的差異,具體為:掃描電鏡下,放大3500倍,視野下可觀察到的子宮內膜上皮細胞數量為250個,每個標本隨機選取50個視野,50個視野內胞飲突的表達數量作為胞飲突評分,計算各組大鼠胞飲突評分均值;5統計學方法:采用SPSS 17.0統計軟件進行數據統計,計量資料以均數±標準差表示,方差齊性檢驗,三組以上采用方差分析,組間差異采用LSD法,兩組數據比較采用t檢驗,以α0.05為檢驗水準,當P0.05時,差異有統計學意義;當P0.05時,差異無統計學意義。結果:1各組SD大鼠一般狀況評估降調節(jié)第5天開始,HDG-HRT及LDG-HRT組大鼠出現躁動,進食量減少等低雌激素癥狀,毛色晦暗;降調第14天,HDG-HRT及LDG-HRT組與自然周期組相比,進食量減少,但無顯著區(qū)別(P=0.100,P=0.120),體重略下降,無統計學差異(P=0.140,P=0.130)。給予雌激素后,降調節(jié)組大鼠進食量增加,體重逐漸上升,低雌激素癥狀消失。處死前,各組大鼠體重無明顯差異(P=0.100),進食量差異無統計學意義(P=0.100)。2 SD大鼠陰道細胞涂片結果自然周期中大鼠陰道細胞涂片呈周期性變化,約4天一周期,依次為動情前期,動情期,動情后期,動情間期。動情前期,持續(xù)約9-18小時,陰道涂片上全部為有核上皮,偶見少量角化細胞;動情期,持續(xù)約1天,陰道涂片顯示全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞;動情后期,持續(xù)約10-14小時,此期陰道涂片顯示為白細胞、角化細胞及有核上皮均有;動情間期,持續(xù)約2-2.5天,此期陰道涂片顯示為大量白細胞及少量上皮細胞和黏液。HRT組大鼠雌激素給藥后,陰道涂片細胞逐漸變化,無核上皮逐漸增多,直至全部為無核上皮。HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠降調節(jié)5天后陰道涂片細胞去周期變化,表現為大量白細胞及少量上皮細胞和黏液,給予雌激素灌胃給藥后逐漸轉變有核上皮至全部變?yōu)闊o核上皮。綜上所述,給予雌激素后,HRT組、HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠陰道細胞涂片逐漸變化,角化上皮逐漸增多直至全部變?yōu)榻腔掀?與動情期陰道細胞學涂片表現一致。3超聲下SD大鼠子宮內膜厚度3.1自然周期SD大鼠生殖周期各期子宮內膜厚度自然周期中大鼠動情周期次序為:動情前期、動情期、動情后期、動情間期,內膜厚度隨動情周期呈周期性變化,分別為2.76±0.08mm,2.82±0.10mm,2.78±0.09mm,2.70±0.07mm。動情期子宮內膜比動情前期、動情后期、動情間期厚(P=0.000,P=0.009,P=0.000)。動情間期子宮內膜最薄,與動情前期相比,無統計學差異(P=0.100);動情后期子宮內膜厚度大于動情間期(P=0.000)。動情前期與動情后期相比,無顯著差異(P=0.160)。3.2各內膜準備方案中大鼠子宮內膜厚度3.2.1降調節(jié)組SD大鼠子宮內膜變化降調節(jié)第1至28天,HDG-HRT組、LDG-HRT組大鼠子宮內膜逐漸變薄,給藥第7天,兩組大鼠內膜厚度與對照組相比,HDG-HRT組內膜厚度低于LDG-HRT組,差異有統計學意義(1.28±0.05mm,1.53±0.1mm,P=0.000)。降調節(jié)第14天、21天、28天,兩組內膜厚度相比,差異無統計學意義(P=0.120,P=0.051,P=0.105)。3.2.2各組SD大鼠用藥情況NC組大鼠沒有使用外源性激素,HRT組大鼠沒有使用降調節(jié)藥物。以內膜厚度達到大鼠自然周期動情期子宮內膜平均厚度2.82mm、陰道細胞涂片表現為全部為無核角化上皮或間有少量上皮細胞時為觀察日,各組大鼠雌激素用藥時間進行比較,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素用藥天數分別為4天,10.9天,9.9天,HRT組短于HDG-HRT組和LDG-HRT組,差異有統計學意義(P=0.000,P=0.000),HDG-HRT組比LDG-HRT組用藥時間長,但無明顯差別(P=0.068);HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組雌激素累計用藥量分別為1.68mg,4.59mg,4.14mg,HRT組顯著低于HDG-HRT組和LDG-HRT組(P=0.000,P=0.000),HDG-HRT組明顯高于LDG-HRT組(P=0.048)。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組黃體酮使用天數及劑量相同。3.2.3內膜轉化期各組SD大鼠子宮內膜厚度NC組大鼠動情期子宮內膜厚度為2.81±0.16mm,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組加用黃體酮日各組子宮內膜厚度依次為2.83±0.2mm,2.83±0.3mm,2.83±0.4mm,各組子宮內膜厚度比較無統計學差異(P=0.110)。4 SD大鼠子宮內膜容受性指標結果4.1光鏡下各組SD大鼠子宮內膜組織形態(tài)比較NC組大鼠腺體數目為9.7±1.6,腺體面積為1870.07±162.93μm2,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組腺體數目分別為9.8±1.5,11.1±1.7,10.8±1.4,腺體面積為1834.87±154.07μm2,2078.76±161.16μm2,2010.88±178.99μm2。HRT組與NC組腺體數目及面積均無顯著差異(P=0.814,P=0.560);HDG-HRT組和LDG-HRT組與NC組相比,腺體數目(P=0.016,P=0.049)及腺體面積(P=0.001,P=0.000)均明顯增大;HDG-HRT組和LDG-HRT組與HRT組相比,腺體數目增多(P=0.028,P=0.041),腺體面積增大(P=0.000,P=0.000);HDG-HRT組與LDG-HRT組之間相比,腺體數目及腺體面積均無統計學差異(P=0.638,P=0.600)綜合以上數據及光鏡下觀察子宮內膜形態(tài),HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組及HRT組相比,腺體數目更多,形態(tài)不規(guī)則,腺體分泌空泡明顯,腺腔分泌物更多,間質疏松水腫更加明顯。4.2 SD大鼠子宮內膜LIF表達情況NC組大鼠種植窗期LIF組織學評分為2.59±0.38,HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組大鼠子宮內膜LIF組織學評分分別為2.58±0.24,2.70±0.42,2.72±0.65,HRT組LIF表達量略低于NC組,但兩組表達量無統計學差異(P=0.657)。HDG-HRT組LIF表達量較LDG-HRT組高,但差異無統計學意義(P=0.460)。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達量顯著高于NC組(P=0.000,P=0.000)。HDG-HRT組、LDG-HRT組LIF表達量顯著高于HRT組(P=0.000,P=0.000)4.3 SD大鼠子宮內膜胞飲突形態(tài)NC組為發(fā)育完全的胞飲突,表達明顯,發(fā)育同步,大小一致,表面光滑,其余內膜表面被短小的微絨毛覆蓋。HRT組胞飲突為發(fā)育中的胞飲突,發(fā)育不同步,大小不一致,表面不甚光滑,余內膜面可見濃密的微絨毛覆蓋。HDG-HRT組為發(fā)育完全的胞飲突,表達明顯,大小一致,發(fā)育同步,形態(tài)飽滿,表面光滑,微絨毛短小。LDG-HRT組胞飲突表達明顯,發(fā)育同步,大小一致,為發(fā)育完全的胞飲突,形態(tài)飽滿,表面較為光滑,余內膜面微絨毛短小。綜上所述,HRT組與NC組相比,胞飲突大小不一致,表面不夠光滑;經Gn RHa預處理的HDG-HRT組、LDG-HRT組與NC組相比,胞飲突發(fā)育完善,形態(tài)更加飽滿,微絨毛短小。4.4 SD大鼠子宮內膜胞飲突評分NC組胞飲突評分為674.8±27.2。HRT組、HDG-HRT組和LDG-HRT組胞飲突評分分別為666.9±27.5,708.4±30.3,716.7±31.4。各組間相比,HRT組與NC之間相比,胞飲突評分無統計學差異(P=0.459);HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分顯著高于NC組(P=0.003,P=0.000);HDG-HRT組、LDG-HRT組胞飲突評分高于HRT組(P=0.000,P=0.000);HDG-HRT組與LDG-HRT組相比,胞飲突評分無統計學差異(P=0.440)。結論:1利用促性腺激素釋放激素、雌激素、黃體酮成功建立大鼠子宮內膜人工周期模型、降調節(jié)聯合人工周期模型。2 HDG-HRT組與LDG-HRT組在光鏡下子宮內膜形態(tài)、電鏡下胞飲突形態(tài)均優(yōu)于NC組及HRT組,子宮內膜腺體數目及面積、LIF表達量、胞飲突評分高于NC組和HRT組,提示Gn RHa能改善子宮內膜容受性。3在降調節(jié)聯合人工周期準備方案中,低劑量Gn RHa即可達到高劑量Gn RHa相同的降調效果,提示臨床中可根據實際情況調整用量。
【關鍵詞】：垂體降調節(jié) 人工周期 SD大鼠 子宮內膜容受性 白血病抑制因子 胞飲突
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-11
• 英文摘要11-18
• 英文縮寫18-19
• 前言19-21
• 材料與方法21-27
• 結果27-31
• 附圖31-38
• 附表38-40
• 討論40-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-52
• 綜述 最具預測價值的子宮內膜容受性標志物52-63
• 參考文獻58-63
• 致謝63-64
• 個人簡歷64

【參考文獻】

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1 郭文宇;劉燦燦;董藝丹;張小旭;張秀文;孫鳳芹;王逸舒;夏雷;;中藥對去勢小鼠生殖系統及行為學的影響[J];江西中醫(yī)藥大學學報;2015年01期

2 阮恒超,黃荷鳳,金帆;不同方案超排卵下小鼠子宮內膜種植窗期整合素β3的表達[J];中華醫(yī)學雜志;2004年10期

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本文編號：550840