本文關(guān)鍵詞：NOS1調(diào)控ABCG2的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌(ovarian cancer. OC)是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤之首,晚期卵巢癌患者5年生存率僅約30%。盡管目前手術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療的治療方案已日臻成熟,但卵巢癌患者的生存率仍然比較低,其中一個(gè)重要的原因是大部分患者最終會(huì)出現(xiàn)化療耐藥而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。因此,深入認(rèn)識(shí)卵巢癌的耐藥機(jī)制,有效改善不良預(yù)后是卵巢癌臨床治療和基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵問題。研究表明,一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)在多種腫瘤組織中普遍表達(dá)增強(qiáng),可促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和化療藥物抵抗。人體有三種NOS(NOS1, NOS2和NOS3)。它們均通過氧化L-精氨酸合成一氧化氮(Nitric oxide, NO). NOS1和NOS3分泌較低濃度的NO,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。而NOS2主要存在于肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,受到外界刺激后被激活,可產(chǎn)生高濃度的NO,誘導(dǎo)炎癥相關(guān)反應(yīng),促進(jìn)或影響腫瘤生長(zhǎng)。低濃度NO促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),而高濃度NO則抑制腫瘤生長(zhǎng)。抑制腫瘤生長(zhǎng)的濃度要比促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)時(shí)濃度高10-100倍。目前已有研究證實(shí),不同的NOS亞型與結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤等惡性腫瘤的化療耐藥表型有關(guān)。此外,NOS1產(chǎn)生的較低濃度的NO對(duì)腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)性作用,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而導(dǎo)致腫瘤耐受化療藥物,導(dǎo)致耐藥乃至腫瘤復(fù)發(fā)。然而,目前關(guān)于NOS 1對(duì)卵巢癌化療敏感性的影響及其調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。高表達(dá)ATP結(jié)合盒G超家族成員2(ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)是介導(dǎo)多種惡性腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)的主要機(jī)制。ABCG2作為一種多次跨膜蛋白,可以利用ATP水解提供的能量主動(dòng)的將腫瘤細(xì)胞中的化療藥物等外來物質(zhì)泵出細(xì)胞外,導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物殺傷作用,是化療失敗的重要因素之一。ABCG2在多種腫瘤細(xì)胞中都報(bào)道其表達(dá)增強(qiáng),包括食管癌、子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌以及黑色素瘤等。卵巢癌細(xì)胞系中ABCG2+細(xì)胞對(duì)化療藥物長(zhǎng)春新堿的耐受性高于ABCG2-細(xì)胞,而ABCG2抗體可增加ABCG2+細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。ABCG2與肺癌、食管癌、急性白血病等多種惡性腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。近年來有研究表明,ABCG2作為還原性物質(zhì)谷胱甘肽(glutathione, GSH)的轉(zhuǎn)運(yùn)子,在細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用。此外,ABCG2可以限制葉綠酸-A以及卟啉類化合物的攝入,從而影響細(xì)胞內(nèi)單態(tài)氧產(chǎn)生,導(dǎo)致DNA水解及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些研究提示,ABCG2對(duì)惡性腫瘤化療敏感性的影響除了其自身藥物泵的生理功能起作用外,還有可能與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡有關(guān)。有研究證實(shí),NOS通過其產(chǎn)物NO促進(jìn)抗氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-la, Nrf2等的活性,上調(diào)抗氧化物質(zhì)SOD、TrxRl的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療后局部組織的缺氧環(huán)境的耐受能力,減少腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)耐藥的發(fā)生發(fā)展。然而,對(duì)于NOS/NO相關(guān)的化療耐藥是否與經(jīng)典的多藥耐藥基因ABCG2有關(guān),兩者之間潛在的機(jī)制如何,尚未見研究報(bào)道。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NOS1可以調(diào)控多藥耐藥基因ABCG2的表達(dá),并且NOS1導(dǎo)致的卵巢癌化療耐藥部分依賴ABCG2的增強(qiáng)。我們進(jìn)一步探索了NOS1調(diào)控ABCG2的可能機(jī)制,以期為逆轉(zhuǎn)卵巢癌的鉑類耐藥、改善卵巢癌患者的預(yù)后提供更新更好的策略。研究目的卵巢癌死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首�；熌退幨瞧鋸�(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乃至死亡的主要原因。本課題前期研究表明NOSs影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)功能,包括增殖、侵襲、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)功能。另外,通過芯片數(shù)據(jù)分析NOS在卵巢癌中表達(dá)增強(qiáng),與卵巢化療耐藥相關(guān)。在此基礎(chǔ)上,本課題從多藥耐藥相關(guān)基因ABCG2入手,探討NOS影響卵巢癌順鉑耐藥的可能機(jī)制。(一)NOS與卵巢癌ABCG2表達(dá)、化療敏感性及預(yù)后的相關(guān)性研究方法1)根據(jù)Pubmed公共資源GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌組織的全基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,討論三種NOS亞型(NOS1, NOS2, NOS3)與ABCG2表達(dá)的相關(guān)性；2)利用Kalan-Meier法分析三種NOS亞型表達(dá)水平與卵巢癌患者生存時(shí)間的相關(guān)性,從而明確NOSs是否可能參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程；3)利用鉑類敏感性卵巢癌組織和耐藥性卵巢癌組織表達(dá)譜芯片,分析三種NOS亞型以及ABCG2的表達(dá)水平與卵巢癌鉑類敏感性的相關(guān)性。研究結(jié)果1)NOS1與ABCG2的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.211,P0.01)；NOS2與ABCG2的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.422, P0.01); NOS3與ABCG2的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.342,P0.01)。提示NOS的三種亞型對(duì)多藥耐藥基因ABCG2的表達(dá)以及卵巢癌化療耐藥可能具有不同的作用；2)NOS1和ABCG2高表達(dá)的卵巢癌患者生存時(shí)間短、預(yù)后差, 其中NOS1和ABCG2相關(guān)顯著性分別為P=0.0421和P=0.0237 (Log-rank Test),但NOS2、NOS3與生存的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3)鉑類耐藥組卵巢癌組織中ABCG2的表達(dá)量顯著高于鉑類敏感組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.184, P0.05); NOS1在鉑類耐藥組中的表達(dá)量高于鉑類敏感組(t=1.189, P=0.245), NOS2在鉑類耐藥組中的表達(dá)量低于鉑類敏感組(t=-0.836,P=0.411), NOS3在兩組中的差異不明顯(t=0.15,P=0.882)。研究結(jié)論1)三種NOS亞型與ABCG2有不同的相關(guān)關(guān)系,其中NOS1及NOS3與ABCG2均呈正相關(guān)關(guān)系,而NOS2與ABCG2呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；2)NOS1與卵巢癌患者的生存時(shí)間相關(guān),NOS2和NOS3與卵巢癌患者的生存時(shí)間無關(guān)；3) ABCG2與卵巢癌患者的生存時(shí)間相關(guān)；(二)NOS1對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響研究方法1)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3和SKOV-3對(duì)順鉑敏感性的差異；2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NOS1過表達(dá)的GV375-NOS1 ov-3和對(duì)照組GV375-NCov-3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性的差異；3)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾NOS1表達(dá)的SKOV-3細(xì)胞si-NOS1 SKOV-3以及對(duì)照細(xì)胞si-NC SKOV-3對(duì)順鉑敏感性的差異。4)預(yù)先使用順鉑聯(lián)合NOS各型抑制劑以及NO供體處理OVCAR-3細(xì)胞,運(yùn)用流式細(xì)胞儀Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡。5) Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑聯(lián)合NOS抑制劑處理對(duì)于卵巢癌細(xì)胞株中ABCG2表達(dá)的影響。研究結(jié)果1)順鉑作用48小時(shí)后的人卵巢上皮性癌細(xì)胞株SKOV-3和OVCAR-3,半數(shù)抑制率(half maximal inhibitory concentration. IC50)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.358,P0.05)；2)順鉑作用48小時(shí)后的人卵巢上皮性癌細(xì)胞株GV375-NOS1 ov-3和GV375-NC ov-3細(xì)胞,IC50之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-25.739,P0.01)；3)順鉑作用48小時(shí)后的人卵巢上皮性癌細(xì)胞株si-NOS1 SKOV-3和si-NC SKOV-3細(xì)胞,IC50之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.128,P0.05)；4)順鉑可以提高卵巢癌細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)量,NOS抑制劑可逆轉(zhuǎn)ABCG2的表達(dá)增強(qiáng)；5)順鉑單獨(dú)作用72小時(shí)或順鉑作用72小時(shí)聯(lián)合NOS抑制劑或NO供體作用48小時(shí)后的OVCAR-3細(xì)胞之間的細(xì)胞凋亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.637,P0.01)；6)順鉑單獨(dú)作用72小時(shí)或順鉑作用72小時(shí)聯(lián)合NOS抑制劑或NO供體作用48小時(shí)后的OVCAR-3細(xì)胞之間的細(xì)胞凋亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.098,P0.01)。研究結(jié)論1)NOS1過表達(dá)增強(qiáng)了OVCAR-3對(duì)順鉑的耐藥性；2)干擾NOS1的表達(dá)增強(qiáng)了SKOV-3對(duì)順鉑的敏感性；3) NOS1特異性抑制劑N-PLA聯(lián)用順鉑相比于順鉑單藥處理,增加了卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及非凋亡性死亡率,N-PLA促進(jìn)了順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用,從而提示抑制NOS1功能增加了卵巢癌的順鉑敏感性；4) 順鉑可以提高卵巢癌細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)量,NOS泛抑制劑和NOS1抑制劑可逆轉(zhuǎn)ABCG2的表達(dá)增強(qiáng),提示NOS1可能通過調(diào)節(jié)ABCG2的表達(dá)調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的順鉑敏感性。(三)NOS1通過上調(diào)ABCG2增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性研究方法1) qRT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)NOS泛抑制劑L-NAME對(duì)卵巢癌細(xì)胞中ABCG2基因表達(dá)的影響；2) Western Blot方法檢測(cè)NOS幾種不同的抑制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞中ABCG2基因表達(dá)的影響；3) Western Blot方法檢測(cè)過表達(dá)NOS1的卵巢癌細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞中ABCG2表達(dá)情況；4)免疫組化檢測(cè)NOS1過表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤組織中ABCG2表達(dá)的影響。5)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABCG2功能抑制劑維拉帕米對(duì)過表達(dá)NOS1的卵巢癌細(xì)胞株的順鉑敏感性的影響。研究結(jié)果1) L-NAME處理后48 h的OVCAR-3細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞相比,ABCG2的mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),ABCG2的蛋白表達(dá)水平明顯降低；2)NOS2特異性抑制劑1400W處理后OVCAR-3細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞相比,ABCG2的蛋白表達(dá)降低；NOS1特異性抑制劑N-PLA處理后ABCG2蛋白表達(dá)量明顯降低;3)NOS1過表達(dá)的GV375-NOS1 ov-3和對(duì)照組GV375-NC ov-3細(xì)胞相比,NOS1的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,ABCG2基因的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞；4)NOS1過表達(dá)的裸鼠皮下移植瘤和對(duì)照組裸鼠皮下移植瘤組織細(xì)胞中的ABCG2陽性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-15.697；P0.01)。5)NOS1過表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,抑制ABCG2的功能可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。研究結(jié)論本章從基因水平驗(yàn)證NOS1可調(diào)控ABCG2的表達(dá)水平,卵巢癌細(xì)胞由于NOS1過表達(dá)而增加的順鉑耐藥性,可以被ABCG2的功能抑制劑逆轉(zhuǎn)。說明NOS1通過調(diào)節(jié)ABCG2調(diào)控卵巢癌的順鉑敏感性。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 NOS 耐藥 ABCG2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一章 NOS與卵巢癌ABCG2表達(dá)、化療敏感性及預(yù)后的相關(guān)性23-27
• 一、引言23
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法23-24
• 三、結(jié)果24-26
• 四、結(jié)論26-27
• 第二章 NOS1對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響27-51
• 一、引言27
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法27-38
• 三、結(jié)果38-50
• 四、結(jié)論50-51
• 第三章 NOS1通過上調(diào)ABCG2增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性51-70
• 一、引言51
• 二、實(shí)驗(yàn)材料與方法51-64
• 三、結(jié)果64-69
• 四、結(jié)論69-70
• 討論70-72
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 綜述74-78
• S每嘉南，
  
  本文編號(hào)：527931
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