本文關(guān)鍵詞：維生素D通過(guò)抑制EMT延緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的目前認(rèn)為90%的卵巢癌起源于卵巢表面上皮細(xì)胞(Ovarian Surface Epithelial Cell,OSEC)。很多研究表明,維生素D可以抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并且改善其預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功建立小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化模型——MOSEC(Mouse Ovarian Surface Epithelial Cell),并且證明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)參與了此過(guò)程。為了研究維生素D是否抑制MOSEC的自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化,本研究通過(guò)維生素D對(duì)MOSEC的連續(xù)性處理,檢測(cè)MOSEC基本性質(zhì)的改變、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)、調(diào)控EMT基因的表達(dá)以及維生素D代謝關(guān)鍵酶等的變化,探討活性維生素D對(duì)MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的作用及其可能機(jī)制。方法1.確定活性維生素D是否對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程有抑制作用在MOSEC體外培養(yǎng)過(guò)程中,從P20(第20代細(xì)胞,下文以此類(lèi)推)開(kāi)始連續(xù)加入1nmol/L活性維生素D直到P120,在此過(guò)程中每隔10代,分別使用平板克隆、軟瓊脂克隆、Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)活性維生素D對(duì)MOSEC惡性轉(zhuǎn)化各個(gè)階段細(xì)胞的體外增殖能力以及遷移能力的影響。用CCK-8檢查活性維生素D是否影響了MOSEC對(duì)紫杉醇的敏感性。裸鼠腹腔注射105個(gè)P90細(xì)胞,比較對(duì)照組和活性維生素D處理組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤及轉(zhuǎn)移情況,從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明活性維生素D是否延緩了卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。2.活性維生素D是否通過(guò)調(diào)節(jié)EMT來(lái)延緩MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程實(shí)驗(yàn)觀(guān)察對(duì)照組和活性維生素D處理組細(xì)胞形態(tài)的改變,使用Western-blotting和免疫熒光檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin和Snail等的表達(dá)變化,并且使用Real-time Q-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)基因SPP1、MMP3、COL3A1及其ESR1等的表達(dá)變化,分析活性維生素D是否通過(guò)調(diào)節(jié)EMT延緩了卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程。3.維生素D代謝關(guān)鍵酶對(duì)MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響實(shí)驗(yàn)使用Real-time Q-PCR與免疫熒光檢測(cè)維生素D代謝關(guān)鍵基因CYP27B1和CYP24A1以及VDR表達(dá)在MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的變化,并且分析活性維生素D對(duì)這一過(guò)程的影響。使用SAS軟件分析傳代次數(shù)和活性維生素D刺激兩種因素的聯(lián)合作用,探討活性維生素D在卵巢表面上皮細(xì)胞不同轉(zhuǎn)化階段的實(shí)際有效作用量,進(jìn)一步闡明活性維生素D延緩卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制。結(jié)果1活性維生素D延緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程(1)體外增殖能力:根據(jù)活性維生素D對(duì)MOSEC的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、遷移能力的作用,將MOSEC的惡性轉(zhuǎn)化階段分為三期,即Ⅰ期(P20-P60)、Ⅱ期(P70-P90)、Ⅲ期(P100-P120)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著MOSEC惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程,活性維生素D雖然增大了Ⅱ和Ⅲ期細(xì)胞的克隆直徑(P0.0005),但是抑制了三個(gè)階段細(xì)胞的克隆形成率(P0.05)。軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,活性維生素D抑制Ⅰ期和Ⅲ期細(xì)胞的克隆形成率(P0.05),但是卻促進(jìn)了Ⅱ期細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成率(P0.05)。(2)體內(nèi)致瘤性:由于活性維生素D促進(jìn)了Ⅱ期MOSEC的體外增增殖能力,因此,本研究使用體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)比較分析P90對(duì)照組與處理組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的變化。與對(duì)照組細(xì)胞相比較,活性維生素D減弱了處理組細(xì)胞的成瘤能力,具體表現(xiàn)為:腫瘤轉(zhuǎn)移灶減少(5.1561g vs 1.2335g),腫瘤組織新生血管的生成和不規(guī)則的多核細(xì)胞減少,腹水形成量減少(13ml vs 4ml),腹水細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞減少,并且抑制了腹水細(xì)胞中N-cadherin、MMP3與CYP24A1的表達(dá)(P0.001),以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明活性維生素D長(zhǎng)期處理的卵巢表面上皮細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力減弱。(3)MOSECP90對(duì)化療藥物的敏感性:隨著紫杉醇濃度的增加,對(duì)照組和維生素D處理組MOSEC的存活率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì),并且在50 n M的濃度時(shí),細(xì)胞存活率最小。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在同一個(gè)濃度下,1,25(OH)2D3處理組MOSEC的細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明性活性維生素D增強(qiáng)了卵巢表面上皮細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。(4)體外遷移能力:在MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,雖然活性維生素D對(duì)P60、P70細(xì)胞的遷移能力沒(méi)有影響(P0.05),但是抑制了其余各代數(shù)細(xì)胞的遷移,并且減弱了P40細(xì)胞在12、24、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕愈合能力(P0.05),說(shuō)明活性維生素D抑制了卵巢表面上皮細(xì)胞的體外遷移能力。2活性維生素D減緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程與調(diào)控EMT有關(guān)(1)細(xì)胞形態(tài)的改變:體外長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中,對(duì)照組MOSEC由上皮細(xì)胞的“鵝卵石形”轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞樣的“紡錘梭形”。活性維生素D在Ⅰ、Ⅲ期抑制這種轉(zhuǎn)化進(jìn)程,而在Ⅱ期卻促進(jìn)了此進(jìn)程。(2)EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá):Western-blotting的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著MOSEC體外惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程,活性維生素D抑制了EMT相關(guān)蛋白N-cadherin、Snail和β-catenin的表達(dá),促進(jìn)了E-cadherin的表達(dá)。免疫熒光與此一致,同時(shí)還顯示活性維生素D抑制了β-catenin向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。說(shuō)明活性維生素D減緩卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程與調(diào)控EMT標(biāo)志蛋白有關(guān)。(3)EMT相關(guān)基因的表達(dá):在MOSEC的Ⅰ期,活性維生素D促進(jìn)了MMP3、ESR1的表達(dá),抑制了SPP1的表達(dá),對(duì)COL3A1的沒(méi)影響,說(shuō)明活性維生素D通過(guò)下調(diào)SPP1、上調(diào)ESR1來(lái)抑制I期細(xì)胞的EMT進(jìn)程。在Ⅱ期,活性維生素D促進(jìn)了SPP1、COL3A1的表達(dá),抑制了MMP3與ESR1的表達(dá)。說(shuō)明活性維生素D在此期通過(guò)下調(diào)MMP3抑制EMT,通過(guò)上調(diào)SPP1、COL3A1與下調(diào)ESR1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力。在Ⅲ期,活性維生素D通過(guò)下調(diào)SPP1和MMP3、上調(diào)ESR1抑制III期細(xì)胞的EMT。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的不同階段,活性維生素D調(diào)控的EMT相關(guān)基因也不同,這可能是它對(duì)不同階段細(xì)胞增殖能力影響不同的原因之一。3活性維生素D延緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與維生素D代謝關(guān)鍵酶的變化有關(guān)Real-time Q-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在MOSEC的自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,對(duì)照組中活性維生素D合成基因CYP27B1、降解基因CYP24A1與維生素D受體(Vitamin D Receptor,VDR)的表達(dá)都呈現(xiàn)一個(gè)正態(tài)分布曲線(xiàn)的趨勢(shì),并且在II期細(xì)胞P70時(shí)達(dá)到最大值�；钚跃S生素D處理刺激了每一個(gè)代數(shù)細(xì)胞中CYP24A1的表達(dá)劇增(p0.05),最高者達(dá)到了15000倍,但是其增長(zhǎng)的幅度不同,在處理組P60和P90的表達(dá)量明顯高于其他代數(shù),也就是說(shuō)CYP24A在Ⅱ期細(xì)胞的表達(dá)比Ⅰ和Ⅲ期高。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)處理組Ⅱ期細(xì)胞CYP27B1與VDR的表達(dá)下降,結(jié)合此期相對(duì)較高表達(dá)的CYP24A1的結(jié)果,說(shuō)明II期活性維生素D的有效作用量減少。與同一代數(shù)對(duì)照組的MOSEC比較,Ⅰ期處理組細(xì)胞CYP27B1與VDR的表達(dá)升高,與此期相對(duì)較低表達(dá)的CYP24A1的結(jié)果結(jié)合分析,說(shuō)明I期活性維生素D的有效作用量增加。同理,Ⅲ期細(xì)胞CYP27A1與VDR的表達(dá)沒(méi)有變化,而CYP24A1的表達(dá)相對(duì)較低結(jié)合發(fā)現(xiàn),說(shuō)明III期活性維生素D的有效作用量增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,在卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的不同階段,雖然加入同樣濃度的活性維生素D干預(yù),但是由于維生素D代謝酶和VDR表達(dá)的變化,導(dǎo)致每一階段活性維生素D的有效作用量不同,對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響也不同。結(jié)論1活性維生素D可以延緩小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程,這與它抑制I期和III期細(xì)胞的體外增殖能力和遷移能力、增加了Ⅱ期細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性、并且減弱II期細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。但是本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)活性維生素D促進(jìn)了Ⅱ期細(xì)胞的增殖能力。2在小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中,活性維生素D通過(guò)上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail和β-cantenin等蛋白表達(dá)抑制了EMT進(jìn)程。但是,在惡性轉(zhuǎn)化的不同時(shí)期,活性維生素D調(diào)控的EMT相關(guān)基因也不同。3在小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,活性維生素D合成基因CYP27B1、降解基因CYP24A1和VDR的變化導(dǎo)致每一階段活性維生素D的有效作用量不同。在I期和III期,CYP27B1和VDR的高表達(dá)以及CYP24A1的低表達(dá)使活性維生素D的有效作用量相對(duì)增加,而在II期,因?yàn)镃YP24A1表達(dá)劇增和VDR表達(dá)減少,使得活性維生素D在此階段的有效作用量減少。
【關(guān)鍵詞】：活性維生素 D 小鼠卵巢表面上皮細(xì)胞 惡性轉(zhuǎn)化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-17
• 第一部分 活性維生素D減緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化17-40
• 1 材料與方法18-26
• 1.1 主要設(shè)備和器材18
• 1.2 主要試劑與試劑配制18-20
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法20-26
• 2 結(jié)果26-36
• 2.1 活性維生素D抑制卵巢表面上皮細(xì)胞的體外增殖能力26-30
• 2.2 活性維生素D減弱了卵巢表面上皮細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力30-34
• 2.3 活性維生素D抑制卵巢表面上皮細(xì)胞的體外遷移能力34-35
• 2.4 活性維生素D增強(qiáng)II期卵巢表面上皮細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性35-36
• 3 討論36-40
• 第二部分 活性維生素D通過(guò)抑制EMT延緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化40-57
• 1 材料與方法40-44
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器40-41
• 1.2 主要試劑與試劑配制方案41
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 2 結(jié)果44-52
• 2.1 活性維生素D對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的影響44-46
• 2.2 活性維生素D對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中EMT相關(guān)蛋白的影響46-49
• 2.3 活性維生素D對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響49-52
• 3 討論52-57
• 第三部分 活性維生素D延緩MOSEC自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化與維生素D代謝酶的變化有關(guān)57-70
• 1 材料與方法58-59
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器58
• 1.2 主要試劑與試劑配制方案58
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法59
• 2 結(jié)果59-66
• 2.1 活性維生素D合成基因CYP27B1 對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響59-61
• 2.2 活性維生素D降解基因CYP24A1 對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響61-64
• 2.3 維生素D受體對(duì)卵巢表面上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響64-66
• 3 討論66-70
• 小結(jié)70-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-86
• 綜述：減緩腫瘤發(fā)生與發(fā)展的神秘物質(zhì) ——維生素D86-97
• 參考文獻(xiàn)91-97
• 研究生期間科研經(jīng)歷及發(fā)表的文章97-98
• 中英縮略語(yǔ)對(duì)照表98-99
• 致謝99-103

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Kuangrong Wei;Yuanming Li;Rongshou Zheng;Siwei Zhang;Zhiheng Liang;Huishan Cen;Wanqing Chen;;Ovary cancer incidence and mortality in China, 2011[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

  本文關(guān)鍵詞：維生素D通過(guò)抑制EMT延緩卵巢表面上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：480869