發(fā)布時(shí)間：2017-05-28 07:13

  本文關(guān)鍵詞：TM4SF1基因?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：實(shí)體的惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依靠腫瘤新生血管的形成,抗腫瘤血管生成藥物早已運(yùn)用到臨床治療方面�？缒に募易宄蓡T1 (Transmembrane 4 super family,TM4SF1)是TM4SF家族(Tetraspanins)的一個(gè)遠(yuǎn)親,高表達(dá)于多種上皮性腫瘤中,在培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中也高表達(dá)。TM4SF1與腫瘤血管的生成密切相關(guān),并被證實(shí)其高表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后正相關(guān)。本課題組前期研究已從用卵巢上皮癌患者腹水癌細(xì)胞構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫(kù)中,篩選出相關(guān)抗原TM4SF1,發(fā)現(xiàn)血清中的TM4SF1自身抗體可作為卵巢上皮癌診斷的血清學(xué)指標(biāo),且下調(diào)TM4SF1的表達(dá),可抑制卵巢上皮癌細(xì)胞株HO8910PM的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移。本研究通過沉默TM4SF1基因在HUVEC的表達(dá),研究TM4SF1對(duì)HUVEC增殖、遷移及血管生成的影響,并將沉默TM4SF1基因的人卵巢癌細(xì)胞HO8910PM與HUVEC共接種于裸鼠皮下,利用活體動(dòng)物成像技術(shù),觀察沉默TM4SF1基因后對(duì)裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成的影響。第一部分慢病毒介導(dǎo)TM4SF1基因沉默的HUVEC及H08910PM穩(wěn)定株的構(gòu)建目的利用RNA干擾技術(shù),建立慢病毒介導(dǎo)TM4SF1基因穩(wěn)定沉默的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞((HUVEC)株及人卵巢癌細(xì)胞(HO8910PM)株。方法設(shè)計(jì)并合成含靶向沉默TM4SF1并同時(shí)表達(dá)GFP或熒光素酶基因的兩種慢病毒載體,并命名為L(zhǎng)V-TM4SF1-RNAi-GFP及LV-TM4SF1-RNAi-Luc,將LV-TM4SF1-RNAi-GFP感染高表達(dá)TM4SF1的HUVEC,經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)定表達(dá)的GFP的細(xì)胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。將LV-TM4SF1-RNAi-Luc感染高表達(dá)TM4SF1的HO8910PM,用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PMo以陰性對(duì)照及空白對(duì)照為對(duì)照,通過RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)兩種穩(wěn)定株中TM4SF1的基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建了靶向沉默TM4SF1并同時(shí)表達(dá)GFP或熒光素酶基因的兩種慢病毒載體,感染并篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株LV-TM4SF1-RNAi-G FP/HUVEC及LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM,與陰性對(duì)照LV-CON-R NAi-GFP/HUVEC (LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM )組及HUVEC (HO8 910PM)空白組相比,LV-TM4SF1 -RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SF1-RN Ai- Luc/HO8910PM組TM4SF1 mRNA表達(dá)顯著下降,為[(0.06±0.02) vs (0.95±0.13)/(1.02±0.13), P0.05] ([(0.05±0.02) vs (0.91±0.13)/(1.04±0.13), P0.05]);蛋白表達(dá)亦明顯降低[(0.13±0.01) vs (0.75± 0.03)/(0.75±0.04), P0.05](0.11±0.01) vs (0.58±0.02)/(0.65±0.03), P0.05]),而陰性對(duì)照]LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC (LV-CON-RNAi--Luc/HO89 10PM)組及HUVEC (HO8910PM)空白組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均大于0.05。結(jié)論利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建出穩(wěn)定沉默TM4SF1的LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SFl-RNAi-Luc/HO8910PM細(xì)胞株。第二部分TM4SF1基因沉默對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究目的 探討TM4SF1基因沉默對(duì)HUVEC的增殖、周期、遷移及血管生成的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分3組：HUVEC空白組,LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM組及LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC組。應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化,FCM檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變,基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞血管生成能力的改變。結(jié)果TM4SF1基因沉默后,HUVEC增殖活性受抑制[72h時(shí)OD值：(0.59±0.06) vs (0.98±0.04)/(1.05±0.05), P0.05];細(xì)胞被阻滯在G0/G1期[(69.30±5.48) vs (54.44±4.09)/(51.69±4.16), P0.05];遷移能力明顯降低[(14.20±4.59) vs (70.60±17.75)/(74.40±16.06), P0.05];管腔樣結(jié)構(gòu)明顯減少[(3.33±1.52) vs(19.66±1.52)/(22.66±2.08), P0.05]。而HUVEC空白組與LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 沉默TM4SF1基因使HUVEC的增殖、遷移及血管生成能力均受抑制。第三部分TM4SF1基因沉默對(duì)卵巢癌腫瘤血管形成影響的體內(nèi)研究目的構(gòu)建適用于小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型,探討TM4SF1基因沉默對(duì)卵巢癌腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管生成的影響。方法用transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細(xì)胞,確定兩種細(xì)胞體外最適合生長(zhǎng)比例。再按已確定的細(xì)胞比例將穩(wěn)定沉默TM4SF1的HUVEC及HO8910PM細(xì)胞株共接種于裸鼠皮下,構(gòu)建適用于小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型。將36只雌性裸鼠隨機(jī)分為6組,分別為A: LV-CON-RNAi-Luc / HO8910PM; B: LV-TM4SFl-RNAi-Luc / HO8910PM; C: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM + LV-CON1-RNA i-GFP/ HUVEC; D: LV-CON-RNAi-Luc / HO8910PM + LV-TM4SF1-R NAi-GFP/HUVEC, E: LV-TM4SF1-RNAi-Luc / HO8910PM + LV-CON1-RNAi-GFP/HUVEC; F: LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-R NAi-GFP/HUVEC。通過活體成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移,通過免疫組化染色技術(shù)觀察各組移植瘤中腫瘤血管形成的情況。結(jié)果transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細(xì)胞,確定兩種細(xì)胞體外最適合生長(zhǎng)比例為HO8910PM/HUVEC: 2/1�；铙w成像系統(tǒng)能夠檢測(cè)體外最小的生物素發(fā)光的腫瘤細(xì)胞數(shù)為102個(gè)。36只裸鼠成瘤率100%,6周時(shí)共死亡4只。到第6周時(shí),共接種HUVEC組(C、D、E、 F)移植瘤體積明顯大于單接種HO8910PM組(A、B)。B組移植瘤體積明顯小于陰性對(duì)照組A[(0.11±0.05)vs(0.87±0.05), P0.05]; D、E、F組移植瘤體積也不同程度的小于陰性對(duì)照組C[(0.26±0.06)/ (0.23±0.07)/(0.04±0.03)vs(0.72±0.08),P均0.05],共接種組中完全沉默組F移植瘤最小,部分沉默組D與E相當(dāng)�；铙w成像系統(tǒng)下觀察移植瘤的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)情況,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),生物發(fā)光熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),但6組均未檢測(cè)到轉(zhuǎn)移瘤,解剖裸鼠未見腹腔各臟器種植及轉(zhuǎn)移瘤。采用RT-PCR及Western blotting方法驗(yàn)證移植瘤TM4SF1的基因和蛋白沉默效果,沉默組明顯低于對(duì)照組,與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。免疫組化染色技術(shù)觀察得出,共接種HO8910PM和HUVEC組(C、D、E、F)的微血管數(shù)明顯高于單接種HO8910PM組(A、B),但僅在共接種組中見到人源化的微血管。單接種組中,對(duì)照組(6.67±1.53)與沉默組(6.33±±0.57)微血管數(shù)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。共接種組中人源化微血管數(shù)占總微血管數(shù)90%以上。從總微血管數(shù)來(lái)看,C組(60.67±5.77)和E組(60.33±±9.07)微血管數(shù)明顯多于D組(36.35±6.42)和F組(31.56±6.11)(P均0.05),而C組和E組、D組和F組之間微血管數(shù)無(wú)明顯差異(P均0.05)。結(jié)論TM4SF1基因沉默使卵巢癌的體內(nèi)生長(zhǎng)及腫瘤血管形成起到明顯的抑制作用,但尚不能確定是否抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：TM4SF1 RNA干擾 慢病毒 GFP 熒光素酶 HUVEC HO8910PM TM4SF1 HUVEC 增殖 周期 遷移 血管生成 TM4SF1 熒光素酶 GFP 裸鼠皮下移植瘤 卵巢癌 生長(zhǎng) 轉(zhuǎn)移 微血管
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 個(gè)人簡(jiǎn)歷3-7
• 摘要7-12
• ABSTRACT12-18
• 第一章 慢病毒介導(dǎo)TM4SF1基因沉默的HUVEC及HO8910PM穩(wěn)定株的構(gòu)建18-47
• 1 材料與方法19-37
• 1.1 材料19-26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法及主要步驟26-37
• 2 結(jié)果37-42
• 2.1 慢病毒介導(dǎo)TM4SF1干擾的HUVEC及HO8910PM的構(gòu)建37-39
• 2.2 RT-PCR檢測(cè)干擾后HUVEC及HO8910PM中TM4SF1基因的表達(dá)39-42
• 3 討論42-46
• 參考文獻(xiàn)46-47
• 第二章 TM4SF1基因沉默對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為影響的體外研究47-62
• 1 材料與方法47-52
• 1.1 材料47-48
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟48-52
• 2 結(jié)果52-57
• 2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(CCK-8法)52-53
• 2.2 細(xì)胞周期的影響(流式細(xì)胞術(shù))53-55
• 2.3 細(xì)胞遷移能力的影響(Transwell小室)55-56
• 2.4 細(xì)胞體外血管生成能力的影響(基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn))56-57
• 3 討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 第三章 TM4SF1基因沉默對(duì)卵巢癌腫瘤血管形成影響的體內(nèi)研究.62-86
• 1 對(duì)象、材料及方法62-70
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象62
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料62-64
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法及主要步驟64-70
• 2 結(jié)果70-79
• 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立70-71
• 2.2 皮下移植瘤的觀察與處理71-74
• 2.3 RT-PCR檢測(cè)各組移植瘤中TM4SF1基因的表達(dá)74-76
• 2.4 Western blotting檢測(cè)各組移植瘤中TM4SF1蛋白的表達(dá)76-77
• 2.5 免疫組化染色技術(shù)觀察各組腫瘤血管的形成77-79
• 3 討論79-83
• 參考文獻(xiàn)83-86
• 綜述TM4SF1在腫瘤血管生成中的作用及活體成像研究86-135
• 1. TM4SF1在惡性腫瘤中的研究現(xiàn)狀86-97
• 1.1 TM4SF1的分子結(jié)構(gòu)86-88
• 1.2 TM4SF1與腫瘤的關(guān)系88-97
• 2. 腫瘤血管生成的體內(nèi)外模型97-104
• 2.1 血管生成的體外模型98-101
• 2.2 血管生成的體內(nèi)模型101-104
• 3. 活體動(dòng)物體內(nèi)成像的研究進(jìn)展104-112
• 3.1 生物發(fā)光技術(shù)105-107
• 3.2 熒光成像技術(shù)107-109
• 3.3 可見光活體成像在腫瘤研究中的應(yīng)用109-112
• 參考文獻(xiàn)112-135
• 全文小結(jié)135-136
• 英文縮略詞136-137
• 致謝137-139
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文139-140
• 附件140-144

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 郝麗梅;李唐棣;梅興國(guó);;紅色熒光蛋白的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2006年02期

2 俸艷英;陽(yáng)志軍;李力;張瑋;;TM4SF1 mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床價(jià)值[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

3 劉虹麟;吳練秋;葉麗亞;婁晉寧;張文健;;共接種淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年05期

4 陽(yáng)志軍;楊光;蔣燕明;冉宇靚;楊治華;張瑋;張潔清;潘忠勉;李力;;卵巢上皮性癌相關(guān)抗原的篩選和血清學(xué)檢測(cè)[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2007年12期

5 張敏;任慧霞;;綠色熒光蛋白在藥學(xué)研究中的應(yīng)用[J];中南藥學(xué);2008年01期

  本文關(guān)鍵詞：TM4SF1基因?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：402163