宮頸癌是嚴(yán)重危害女性健康的疾病之一,而人乳頭瘤病毒(HPV)的感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要因素。雖然目前已經(jīng)有三種預(yù)防性HPV疫苗批準(zhǔn)上市,能夠保護約90%的HPV感染引起的宮頸癌,但其對已經(jīng)建立的HPV持續(xù)感染、癌前病變及癌癥并沒有治療效果。因此,研發(fā)有效的治療性HPV疫苗對于臨床治療HPV相關(guān)腫瘤具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵的免疫抑制分子,其能夠誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),分化的Treg細(xì)胞通過多種機制顯著抑制效應(yīng)T細(xì)胞分化、增殖及功能。TGF-β1促進骨髓來源免疫抑制細(xì)胞(MDSCs)分化、增殖及向腫瘤遷移。此外,TGF-β 1也可促腫瘤細(xì)胞增殖、促腫瘤血管生成、刺激細(xì)胞外基質(zhì)表達等促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。除了 Treg細(xì)胞,腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞MDSCs、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、以及成纖維細(xì)胞等都能夠表達TGF-β1。因此,靶向TGF-β 1進行干預(yù),具有拮抗腫瘤免疫抑制微環(huán)境,促進抗腫瘤免疫的潛力。Toll-樣受體(TLR)3/9以及STING激動劑cGAMP顯示了強效的誘導(dǎo)Thl/CTLs偏向的細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力,是有潛力的腫...

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    一、HPV的生物學(xué)特征及致病機制
    二、HPV治療性疫苗研究現(xiàn)狀
    三、腫瘤微環(huán)境的作用機制
    四、TGF-β在腫瘤中的重要作用
    五、抗細(xì)胞因子主動免疫策略的應(yīng)用前景
    六、新型佐劑在提高疫苗作用中的影響
    七、納米顆粒靶向遞送抗原在腫瘤治療中的重要作用
    八、研究目的及意義
第一部分 靶向TGF-β1主動免疫對HPV16病毒樣顆粒治療性疫苗作用的影響
    1 引言
    2 實驗材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株
            2.1.2 實驗動物
            2.1.3 實驗試劑及耗材
        2.2 實驗方法
            2.2.1 呈遞TGF-β1_67-75的重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達
            2.2.3 硫酸銨鹽析法初步純化重組蛋白
            2.2.4 蔗糖密度梯度離心純化目的蛋白
            2.2.5 Sephadex G25脫鹽
            2.2.6 BCA蛋白質(zhì)定量
            2.2.7 病毒樣顆粒鑒定
            2.2.8 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.9 小鼠HPV16移植腫瘤模型的建立
            2.2.10 皮下免疫
            2.2.11 靶向抑制TGFβ1并結(jié)合HPV16治療性疫苗對小鼠腫瘤模型干預(yù)實驗研究
            2.2.12 采血
            2.2.13 小鼠血清IgGI、IgG2a抗體水平檢測
            2.2.14 小鼠脾臟及腫瘤組織的獲取
            2.2.15 體外分離小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞
            2.2.16 體外分離小鼠腫瘤組織淋巴細(xì)胞
            2.2.17 ELISA檢測脾細(xì)胞刺激上清的細(xì)胞因子表達
            2.2.18 ELISPOT檢測分泌IFN-γ的T細(xì)胞的水平
            2.2.19 流式細(xì)胞術(shù)檢測CTL細(xì)胞水平
            2.2.20 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1細(xì)胞水平
            2.2.21 流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞水平
            2.2.22 免疫組化
            2.2.23 腫瘤組織總RNA提取
            2.2.24 腫瘤組織mRNA的逆轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測
            2.2.25 Western Blot
    3 結(jié)果與分析
        3.1 HBcAg- TGFβ1_67-75重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.2 重組蛋白的純化
        3.3 病毒樣顆粒的鑒定
            3.3.1 病毒樣顆粒的HPLC分析
            3.3.2 病毒樣顆粒的電鏡觀察
        3.4 TGFβ1 VLPs聯(lián)合免疫HPV16治療性疫苗對小鼠腫瘤模型的干預(yù)研究
            3.4.1 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對小鼠腫瘤生長的影響
            3.4.2 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對IgG1/IgG2a應(yīng)答偏向性的影響
            3.4.3 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對細(xì)胞因子應(yīng)答的影響
            3.4.4 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞水平的影響
            3.4.5 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對脾臟Th1、CTLs效應(yīng)淋巴細(xì)胞水平的影響
            3.4.6 HβcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對脾臟組織Treg細(xì)胞水平的影響
            3.4.7 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對腫瘤組織中E7特異的CTL細(xì)胞和Treg細(xì)胞的影響
            3.4.8 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs聯(lián)合免疫對腫瘤組織血管生成以及VEGF基因表達的影響
            3.4.9 聯(lián)合免疫對腫瘤微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子以及趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平的影響
            3.4.10 靶向TGFβ1對腫瘤組織中TGFβ1信號通路激活的影響
    4 討論
        4.1 疫苗聯(lián)合療法是有效的腫瘤干預(yù)新手段
        4.2 TGF-β1作為調(diào)控靶點并聯(lián)合治療性疫苗的潛能及安全性
        4.3 應(yīng)用VLP作為載體利于打破自身蛋白的免疫耐受
        4.4 靶向TGF-β1并聯(lián)合VLPs治療性疫苗對小鼠腫瘤干預(yù)潛能
        4.5 聯(lián)合免疫TGF-β1 VLPs和VLPs治療性疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)評價
        4.6 聯(lián)合免疫對腫瘤血管、相關(guān)趨化因子的影響
        4.7 靶向TGF-β的作用機制初步評價
    5 小結(jié)
第二部分 核酸免疫刺激物及納米顆粒佐劑對HPV16 E7抗原激發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
    1 引言
    2 實驗材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 實驗動物
            2.1.2 實驗所需抗體
            2.1.3 實驗所需主要耗材
            2.1.4 實驗所需主要試劑
            2.1.5 實驗所需主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 體外分離及培養(yǎng)BMDCs細(xì)胞
            2.2.2 FITC體外標(biāo)記HBcAg-E7_49-57 VLPs
            2.2.3 共聚焦顯微鏡觀察DOTAP有效促進BMDCs對HBcAg-E7_49-57 VLPs的攝取
            2.2.4 DOTAP有效促進BMDCs對HBcAg-E7_49-57VLPs的攝取效率
            2.2.5 檢測BMDCs的成熟情況
            2.2.6 核酸佐劑聯(lián)合應(yīng)用對HBcAg-E7_49-57 VLPs促進BMDCs的MHC-I遞呈的影響
            2.2.7 ELISA檢測BMDCs刺激上清炎性細(xì)胞因子的含量
            2.2.8 HBcAg-E7_49-57重組蛋白的表達純化以及病毒樣顆粒的鑒定
            2.2.9 DOTAP遞送核酸佐劑對HBcAg-E7_49-57 VLPs免疫干預(yù)的影響
            2.2.10 ELISPOT檢測分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞水平
            2.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記
            2.2.12 包裹抗原及核酸佐劑的納米顆粒的制備
            2.2.13 包裹抗原的納米粒的電鏡觀察以及粒徑分析
    3 實驗結(jié)果
        3.1 CpG、PolyI:C的協(xié)同作用對E7特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
            3.1.1 CpG和PolyI:C作為佐劑的協(xié)同效應(yīng)對小鼠腫瘤生長的影響
            3.1.2 CpG和PolyI:C作為佐劑的協(xié)同效應(yīng)對E7特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
        3.2 DOTAP陽離子脂質(zhì)體遞送核酸佐劑對HBcAg-E7_49-57VLPs抗腫瘤作用的影響
            3.2.1 體外培養(yǎng)BMDCs的純度測定
            3.2.2 DOTAP對BMDCs攝取HBcAg-E7_49-57 VLPs效率的影響
            3.2.3 DOTAP對HBcAg-E7_49-57 VLPs促進BMDCs成熟的影響
            3.2.4 核酸佐劑聯(lián)合應(yīng)用對HBcAg-E7_49-57 VLPs促進BMDCs的MHC-I遞呈的影響
            3.2.5 DOTAP遞送核酸佐劑以及HBcAg-E7_49-57 VLPs對小鼠腫瘤生長的影響
            3.2.6 DOTAP遞送核酸佐劑以及HBcAg-E7_49-57 VLPs對分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞水平的影響
            3.2.7 DOTAP遞送核酸佐劑以及HBcAg-E7_49-57 VLPs對Th1/CTLs淋巴細(xì)胞水平的影響
            3.2.8 DOTAP遞送核酸佐劑以及HBcAg-E7_49-57 VLPs對免疫抑制細(xì)胞水平的影響
            3.2.9 DOTAP遞送核酸佐劑以及HBcAg-E7_49-57 VLPs對記憶T細(xì)胞水平的影響
        3.3 新型納米顆粒靶向遞送核酸佐劑對E7特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
            3.3.1 含不同組分的納米顆粒的性質(zhì)鑒定
            3.3.2 納米顆粒遞送核酸佐劑促BMDCs成熟的作用
            3.3.3 納米顆粒遞送核酸佐劑促進BMDCs分泌促炎性細(xì)胞因子
            3.3.4 預(yù)防性策略檢測納米顆粒遞送核酸佐劑對小鼠腫瘤生長的影響
            3.3.5 預(yù)防性策略檢測納米顆粒遞送核酸佐劑對小鼠抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
            3.3.6 治療性策略檢測納米顆粒遞送核酸佐劑對小鼠腫瘤生長的影響
            3.3.7 治療性策略檢測納米顆粒遞送核酸佐劑對小鼠抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
    4 討論
        4.1 核酸佐劑對免疫系統(tǒng)的影響
        4.2 樹突狀細(xì)胞對抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
        4.3 核酸佐劑協(xié)同作用以及納米顆粒遞送系統(tǒng)的應(yīng)用對治療性疫苗的抗腫瘤干預(yù)潛能的影響
        4.4 核酸佐劑協(xié)同作用以及納米顆粒遞送系統(tǒng)的應(yīng)用對抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
    5 小結(jié)
        5.1 CpG、PolyI:C的協(xié)同作用對E7特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
        5.2 DOTAP陽離子脂質(zhì)體遞送核酸佐劑對HBcAg-E7_49-57 VLPs抗腫瘤作用的影響
        5.3 納米材料靶向遞送核酸佐劑對E7特異的抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響
展望
參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 英文縮寫詞
    附錄Ⅱ 主要溶液的配制
致謝
個人簡歷



本文編號：3845543