目的多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期女性常見的內分泌紊亂疾病,但目前發(fā)病機制尚不明確。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈RNA,可調控基因轉錄后表達。DNA甲基化是影響miRNA表達的重要機制之一。研究發(fā)現,miRNA表達異常參與PCOS相關病理改變。本實驗檢測卵巢顆粒細胞miRNA-28-5p及其可能靶基因PROK1表達,并檢測miRNA-28-5p甲基化改變和miRNA-28-5p/PROK1信號軸對顆粒細胞功能的影響及其細胞信號傳導通路,旨在為miRNA-28-5p在PCOS疾病的早期診斷以及治療等方面的臨床應用提供理論依據。方法建造PCOS大鼠模型,qRT-PCR檢測正常組和PCOS組卵巢顆粒細胞miRNA-28-5p表達,MSP檢測miRNA-28-5p啟動子甲基化狀態(tài),CCK-8,EDU染色,流式細胞儀和Western blot實驗檢測5-Aza-CdR處理對顆粒細胞增生和凋亡的影響。之后,生物分析軟件篩選miRNA-28-5p的可能靶基因PROK1。qRT-PCR和Western blot實驗檢測檢測正常組...

【文章頁數】：134 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 PCOS大鼠卵巢顆粒細胞MicroRNA-28-5p甲基化狀態(tài)的研究
    1.1 實驗方法
        1.1.1 實驗對象
        1.1.2 實驗試劑
        1.1.3 實驗器材
        1.1.4 相關試劑配制
        1.1.5 PCOS動物模型構建
        1.1.6 陰道涂片檢測
        1.1.7 標本采集與處理
        1.1.8 卵巢組織H&E染色
        1.1.9 大鼠總睪酮(TT)和性激素結合蛋白(SHBG)檢測
        1.1.10 細胞培養(yǎng)
        1.1.11 免疫熒光鑒定
        1.1.12 5-Aza-CdR處理細胞
        1.1.13 實時熒光定量PCR
        1.1.14 甲基化特異性PCR (MSP)實驗
        1.1.15 miRNA-28-5p抑制劑轉染
        1.1.16 CCK-8實驗
        1.1.17 Edu實驗
        1.1.18 流式細胞儀檢測細胞凋亡
        1.1.19 流式細胞儀檢測細胞周期
        1.1.20 Wetern blot實驗
        1.1.21 統(tǒng)計分析
    1.2 實驗結果
        1.2.1 大鼠體重稱量結果
        1.2.2 大鼠陰道涂片結果
        1.2.3 卵巢組織形態(tài)學觀察
        1.2.4 大鼠總睪酮(TT)和性激素結合蛋白(SHBG)檢測結果
        1.2.5 建模成功率
        1.2.6 大鼠卵巢顆粒細胞的觀察
        1.2.7 大鼠卵巢顆粒細胞的鑒定
        1.2.8 顆粒細胞miRNA-28-5p的表達
        1.2.9 顆粒細胞miRNA-28-5p的甲基化狀態(tài)
        1.2.10 甲基化抑制劑對顆粒細胞miRNA-28-5p表達的影響
        1.2.11 甲基化抑制劑對顆粒細胞miRNA-28-5p甲基化狀態(tài)的影響
        1.2.12 CCK-8實驗檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細胞活性
        1.2.13 EdU染色流式細胞儀檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細胞增殖
        1.2.14 流式細胞儀檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡
        1.2.15 流式細胞儀檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細胞周期阻滯
        1.2.16 Western blot實驗檢測凋亡和細胞周期相關蛋白表達
    1.3 小結
    1.4 討論
第二章 MicroRNA-28-5p/PROK1信號軸對PCOS卵巢顆粒細胞功能調控的分子機制研究
    2.1 實驗方法
        2.1.1 實驗試劑
        2.1.2 實驗器材
        2.1.3 篩選miRNA-28-5p靶基因
        2.1.4 miRNA-28-5p mimics轉染
        2.1.5 實時熒光定量PCR
        2.1.6 雙熒光素酶報告基因
        2.1.7 PROK1過表達載體構建
        2.1.8 PROK1過表達載體轉染
        2.1.9 CCK-8實驗
        2.1.10 EdU實驗
        2.1.11 流式細胞儀檢測細胞凋亡
        2.1.12 流式細胞儀檢測細胞周期
        2.1.13 Wetern blot實驗
        2.1.14 統(tǒng)計分析
    2.2 實驗結果
        2.2.1 篩選miRNA-28-5p靶基因
        2.2.2 顆粒細胞PROK1的表達
        2.2.3 miRNA-28-5p對PROK1的調控作用
        2.2.4 PROK1野生型載體(psiCHECK-2-PROK1-WT)的鑒定
        2.2.5 PROK1突變型載體(psiCHECK-2-PROK1-MUT)的鑒定
        2.2.6 雙熒光素酶報告基因
        2.2.7 PROK1過表達載體(pcDNA3.0-PROK1)的鑒定
        2.2.8 PROK1過表達載體(pcDNA3.0-PROK1)轉染的鑒定
        2.2.9 CCK-8實驗檢測大鼠卵巢顆粒細胞活性
        2.2.10 EdU染色流式細胞儀檢測大鼠卵巢顆粒細胞增殖
        2.2.11 流式細胞儀檢測大鼠卵巢顆粒細胞凋亡
        2.2.12 流式細胞儀檢測PCOS大鼠卵巢顆粒細胞周期阻滯
        2.2.13 Western blot實驗檢測凋亡和細胞周期相關蛋白表達
        2.2.14 Western blot實驗檢測PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達
    2.3 小結
    2.4 討論
參考文獻
攻讀學位期間成果
縮略詞
致謝



本文編號：3794722