目的多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂疾病,但目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼單鏈RNA,可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。DNA甲基化是影響miRNA表達(dá)的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),miRNA表達(dá)異常參與PCOS相關(guān)病理改變。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p及其可能靶基因PROK1表達(dá),并檢測(cè)miRNA-28-5p甲基化改變和miRNA-28-5p/PROK1信號(hào)軸對(duì)顆粒細(xì)胞功能的影響及其細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,旨在為miRNA-28-5p在PCOS疾病的早期診斷以及治療等方面的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法建造PCOS大鼠模型,qRT-PCR檢測(cè)正常組和PCOS組卵巢顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p表達(dá),MSP檢測(cè)miRNA-28-5p啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),CCK-8,EDU染色,流式細(xì)胞儀和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-Aza-CdR處理對(duì)顆粒細(xì)胞增生和凋亡的影響。之后,生物分析軟件篩選miRNA-28-5p的可能靶基因PROK1。qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檢測(cè)正常組...

【文章頁(yè)數(shù)】：134 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞MicroRNA-28-5p甲基化狀態(tài)的研究
    1.1 實(shí)驗(yàn)方法
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材
        1.1.4 相關(guān)試劑配制
        1.1.5 PCOS動(dòng)物模型構(gòu)建
        1.1.6 陰道涂片檢測(cè)
        1.1.7 標(biāo)本采集與處理
        1.1.8 卵巢組織H&E染色
        1.1.9 大鼠總睪酮(TT)和性激素結(jié)合蛋白(SHBG)檢測(cè)
        1.1.10 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.1.11 免疫熒光鑒定
        1.1.12 5-Aza-CdR處理細(xì)胞
        1.1.13 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        1.1.14 甲基化特異性PCR (MSP)實(shí)驗(yàn)
        1.1.15 miRNA-28-5p抑制劑轉(zhuǎn)染
        1.1.16 CCK-8實(shí)驗(yàn)
        1.1.17 Edu實(shí)驗(yàn)
        1.1.18 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        1.1.19 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
        1.1.20 Wetern blot實(shí)驗(yàn)
        1.1.21 統(tǒng)計(jì)分析
    1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.2.1 大鼠體重稱(chēng)量結(jié)果
        1.2.2 大鼠陰道涂片結(jié)果
        1.2.3 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察
        1.2.4 大鼠總睪酮(TT)和性激素結(jié)合蛋白(SHBG)檢測(cè)結(jié)果
        1.2.5 建模成功率
        1.2.6 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的觀(guān)察
        1.2.7 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定
        1.2.8 顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p的表達(dá)
        1.2.9 顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p的甲基化狀態(tài)
        1.2.10 甲基化抑制劑對(duì)顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p表達(dá)的影響
        1.2.11 甲基化抑制劑對(duì)顆粒細(xì)胞miRNA-28-5p甲基化狀態(tài)的影響
        1.2.12 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活性
        1.2.13 EdU染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖
        1.2.14 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡
        1.2.15 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞周期阻滯
        1.2.16 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)
    1.3 小結(jié)
    1.4 討論
第二章 MicroRNA-28-5p/PROK1信號(hào)軸對(duì)PCOS卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)控的分子機(jī)制研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材
        2.1.3 篩選miRNA-28-5p靶基因
        2.1.4 miRNA-28-5p mimics轉(zhuǎn)染
        2.1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因
        2.1.7 PROK1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建
        2.1.8 PROK1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染
        2.1.9 CCK-8實(shí)驗(yàn)
        2.1.10 EdU實(shí)驗(yàn)
        2.1.11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.1.12 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
        2.1.13 Wetern blot實(shí)驗(yàn)
        2.1.14 統(tǒng)計(jì)分析
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 篩選miRNA-28-5p靶基因
        2.2.2 顆粒細(xì)胞PROK1的表達(dá)
        2.2.3 miRNA-28-5p對(duì)PROK1的調(diào)控作用
        2.2.4 PROK1野生型載體(psiCHECK-2-PROK1-WT)的鑒定
        2.2.5 PROK1突變型載體(psiCHECK-2-PROK1-MUT)的鑒定
        2.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因
        2.2.7 PROK1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.0-PROK1)的鑒定
        2.2.8 PROK1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA3.0-PROK1)轉(zhuǎn)染的鑒定
        2.2.9 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活性
        2.2.10 EdU染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖
        2.2.11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡
        2.2.12 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞周期阻滯
        2.2.13 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)
        2.2.14 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)
    2.3 小結(jié)
    2.4 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間成果
縮略詞
致謝



本文編號(hào)：3794722