[研究目的]GRSF1被確認為是一個高峰度含“G”的RNA靶定蛋白,其在包括RNA的轉(zhuǎn)運和定位,RNA的穩(wěn)定性,RNA剪切轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的許多步驟中起著非常重要的作用,主要是以序列和結(jié)構(gòu)特異的形式通過RNA結(jié)合域靶定特定的mRNAs來發(fā)揮其功能。最近有研究者報道,GRSF1能夠與Inc-RMRP互作并可以促使Inc-RMRP定位在線粒體基質(zhì);而,Inc-RMRP是RNase MRP復(fù)合體非常重要的一個組分,并且參與酵母核糖體RNA的加工過程;這就意味著說,GRSF1可以介導(dǎo)非編碼RNA調(diào)控核糖體RNA的加工及合成過程。我們前期的工作也已經(jīng)證明GRSF1可以介導(dǎo)非編碼小RNA,miR-346,促進其靶基因hTERT的表達并且不依賴AG02的存在;這也將為非編碼小RNA上調(diào)其靶基因提供了一種新的思路。因此,本篇論文旨在探究,GRSF1介導(dǎo)miRNAs上調(diào)其靶基因是否存在一定的普遍性。[研究方法]我們首先用F1ag-GRSF1-RIP實驗結(jié)合深度測序技術(shù)檢測了Flag-GRSF1復(fù)合體中富集的一些非編碼小RNAs(miRNAs),用RT-qPCR實驗驗證了這些富集的miRNAs的表達情況。結(jié)合測...

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、分析并驗證Flag-GRSF1免疫共沉淀-深度測序復(fù)合體中富集的新的miRNAs
    1.1 材料和方法
        1.1.1 實驗材料
        1.1.2 實驗方法
        1.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 RIP實驗提取的復(fù)合物中RNA的質(zhì)量結(jié)果
        1.2.2 熱圖分析RIP實驗復(fù)合物高通量測序結(jié)果
        1.2.3 在深度測序結(jié)果中分析新的miRNAs堿基序列分布
        1.2.4 GO和KEGG軟件分析高通量測序結(jié)果中新的miRNAs靶基因分布情況
    1.3 討論
    1.4 小結(jié)
二、實驗驗證未知miRNAs的存在性及解析miR-G-1的表達
    2.1 材料和方法
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 實驗方法
        2.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 12個新的miRNAs在HeLa細胞中的分布
        2.2.2 生物學(xué)軟件結(jié)合測序結(jié)果預(yù)測miR-G-1的前體結(jié)果及成熟提序列
        2.2.3 Northernblot驗證miR-G-1的存在
        2.2.4 HeLa和S12中檢測miR-G-1-3p和miR-G-1-5p的表達水平
        2.2.5 不同腫瘤細胞系中miR-G-1-5p的表達水平
        2.2.6 宮頸癌患者的血清樣本及組織樣本中miR-G-1-5p的表達水平
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
三、miR-G-1作為促癌基因在宮頸癌細胞中發(fā)揮著重要作用
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗方法
        3.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 過表達質(zhì)粒pri-miR-G-1和敲降質(zhì)粒Anti-miR-G-1的有效性
        3.2.2 miR-G-1促進宮頸癌細胞的生長活性
        3.2.3 miR-G-1促進HeLa和C33A細胞的集落形成能力
        3.2.4 miR-G-1促進宮頸癌細胞的EdU嵌合率
        3.2.5 miR-G-1促進宮頸癌細胞的周期進程
        3.2.6 miR-G-1抑制了Hela和C33A細胞的細胞凋亡
        3.2.7 miR-G-1抑制宮頸癌細胞的失巢凋亡
        3.2.8 miR-G-1加快EMT過程
        3.2.9 miR-G-1促進宮頸癌細胞的細胞核自噬行為
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
四、miR-G-1靶基因的預(yù)測和確定
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 miR-G-1候選靶基因的篩選
        4.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-G-1的靶基因
        4.2.2 熒光報告系統(tǒng)實驗驗證miR-G-1對預(yù)測候選靶基因的直接靶定作用
        4.2.3 熒光報告載體的Westernblot實驗驗證TMED5和LMNB1是miR-G-1的直接靶基因
        4.2.4 miR-G-1上調(diào)LMNB1和TMED5 mRNA的表達水平
        4.2.5 miR-G-1上調(diào)靶基因LMNB1和TMED5蛋白的表達
        4.2.6 miR-G-1在體內(nèi)能促進LMNB1和TMED5的表達
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
五、TMED5在宮頸癌細胞中所起的作用
    5.1 實驗材料與實驗方法
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 實驗方法
        5.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 pTMED5和shR-TMED5質(zhì)粒的有效性驗證
        5.2.2 TMED5對HeLa和C33A細胞生長活性的影響
        5.2.3 TMED5對HeLa和C33A細胞增殖能力的影響
        5.2.4 TMED5促進HeLa和C33A細胞周期G1期向S/G2期的轉(zhuǎn)換
        5.2.5 TMED5抑制HeLa和C33A細胞的凋亡
        5.2.6 TMED5促進宮頸癌細胞的遷移侵襲能力…
        5.2.7 TMED5促進HeLa細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程
        5.2.8 TMED5的表達量與宮頸癌患者的惡性程度相關(guān)
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
六、TMED5和WNT7B相互作用調(diào)控WNT信號通路
    6.1 材料與方法
        6.1.1 實驗材料
        6.1.2 實驗方法
    6.2 實驗結(jié)果
        6.2.1 STRING預(yù)測TMED5的相互作用蛋白
        6.2.2 免疫熒光實驗分析TMED5和WNT7B在細胞內(nèi)的分布情況
        6.2.3 免疫共沉淀實驗驗證TMED5和WNT7B的相互作用
        6.2.4 TMED5能夠促進WNT7B的表達
        6.2.5 免疫熒光實驗檢測β-catenin的分布及表達量
        6.2.6 TMED5對WNT信號通路相關(guān)蛋白的影響
        6.2.7 TMED5對TOP/FOP報告系統(tǒng)活性的影響
    6.3 討論
    6.4 小結(jié)
七.miR-G-1通過LMNB1調(diào)控宮頸癌細胞的核自噬行為進而影響了DNA損傷復(fù)
    7.1 材料與方法
        7.1.1 實驗材料
        7.1.2 實驗方法
        7.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法實驗
    7.2 結(jié)果
        7.2.1 免疫熒光檢測LMNB1對HeLa細胞核自噬行為的影響
        7.2.2 Westernblot實驗檢測LMNB1對自噬相關(guān)蛋白的影響
        7.2.3 LMNB1對DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的影響
    7.3 討論
    7.4 小結(jié)
八.GRSF1介導(dǎo)miR-G-1上調(diào)其靶基因TMED5和LMNB1
    8.1 材料與方法
        8.1.2 實驗方法
    8.2 實驗結(jié)果
        8.2.1 GRSF1介導(dǎo)miR-G-1上調(diào)TMED5和LMNB1
        8.2.2 shR-GRSF1在HeLa細胞的敲降效率
        8.2.3 敲降GRSF1的HeLa細胞中熒光報告基因系統(tǒng)中EGFP的表達….….
        8.2.4 我們構(gòu)建并驗證GRSF1的4個分片段的有效性
        8.2.5 EMSA檢測GRSF1與miR-G-1的結(jié)合
        8.2.6 EMSA檢測GRSF1的4個分片段與miR-G-1的結(jié)合
    8.3 討論
    8.4 小結(jié)
全文結(jié)論
本文創(chuàng)新點
參考文獻
發(fā)表論文和參加科研情況說明
綜述 非編碼小RNA調(diào)控其靶基因表達的分子機制及自噬行為的研究進展
    綜述參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3749195