目的:探討沉默KDM5A基因表達(dá)對卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP耐藥性的影響及其機(jī)制。方法:選擇高表達(dá)KDM5A的SKOV3/DDP細(xì)胞,設(shè)計(jì)KDM5A基因靶向的發(fā)夾狀shRNA,篩選出最佳shRNA沉默片段,構(gòu)建攜帶有目的基因的重組慢病毒干擾載體并感染SKOV3/DDP細(xì)胞,通過嘌呤霉素篩選,RT-PCR和Western blot法驗(yàn)證,建立穩(wěn)定干擾KDM5A表達(dá)的細(xì)胞株SKOV3/DDP-KDM5Ai。將實(shí)驗(yàn)分為3組,即KDM5A沉默組（SKOV3/DDP-KDM5Ai）、陰性對照組（SKOV3/DDP-NC）和空白對照組（SKOV3/DDP）,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期比例及凋亡情況; CCK-8法檢測細(xì)胞的IC₅₀;高效液相色譜分析法檢測在不同質(zhì)量濃度（7.5μg/ml和15μg/ml）順鉑作用48h后細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。RT-PCR技術(shù)和Western blot法細(xì)胞中β-catenin、P-gp及COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:成功建立KDM5A基因表達(dá)沉默的SKOV3/DDP細(xì)胞株。SKOV3/DDP-KDM5Ai組細(xì)胞凋亡率增高,G... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1主要試劑與儀器
    1.2細(xì)胞株及質(zhì)粒
    1.3方法
        1.3.1 RT-q PCR檢測SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞中KDM5A mRNA表達(dá)
        1.3.2 Western blot法檢測SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞中KDM5A蛋白表達(dá)
        1.3.3 KDM5A基因表達(dá)沉默的SKOV3/DDP細(xì)胞株的構(gòu)建
        1.3.4實(shí)驗(yàn)分組
        1.3.5流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞周期比例和凋亡情況
        1.3.6 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對順鉑的耐藥性
        1.3.7高效液相色譜法檢測不同順鉑濃度作用下細(xì)胞內(nèi)藥物濃度變化
        1.3.8 RT-PCR法檢測細(xì)胞中β-catenin、P-gp及COX-2基因表達(dá)
        1.3.9 Western blot法檢測細(xì)胞中β-catenin、P-gp及COX-2蛋白表達(dá)
    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2 結(jié)果
    2.1 RT-q PCR法及Western blot法檢測卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP及親本細(xì)胞SKOV3中KDM5A表達(dá)
    2.2 穩(wěn)定干擾KDM5A表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株SK-OV3/DDP-KDM5Ai的構(gòu)建
        2.2.1最佳干擾KDM5A表達(dá)的shRNA的篩選
        2.2.2干擾KDM5A表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株SKOV3/DDP-KDM5Ai的鑒定
    2.3 轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞周期分布及凋亡情況的比較
    2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對順鉑耐藥性的比較
    2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中β-catenin、P-gp及COX-2表達(dá)水平
3 討論
    3.1 KDM5A與腫瘤耐藥的關(guān)系
    3.2 KDM5A參與卵巢癌耐藥的分子機(jī)制


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]沉默RBP-2基因?qū)ψ仙即寄退幍穆殉采掀ば园┘?xì)胞系SKOV3/PTX細(xì)胞耐藥性的影響[J]. 馮同富,王燕,李力,郎雁,熊俊,張?jiān)?  中華婦產(chǎn)科雜志. 2017 (07)
[2]紫杉醇誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞株的生物學(xué)特性及其保存[J]. 樊蓓,李紅霞,吳玉梅,趙群,鄧小虹.  腫瘤防治研究. 2015(04)



本文編號：3655603