目的1.探討子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中Ras基因表達與ERK/NF-кB通路之間表達的相關性及可能機制;2.探討Ras基因調(diào)控ERK/NF-кB通路影響在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、侵襲性的變化。方法1.選取2018年9月至2019年6月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院婦科“腹腔鏡卵巢囊腫剝除”、術后病理科診斷子宮內(nèi)膜異位癥的育齡期婦女患者15例,術中取得在位子宮內(nèi)膜組織。分離、培養(yǎng)、提純在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,穩(wěn)定傳代后通過細胞免疫化學及細胞免疫熒光化學進行間質(zhì)細胞鑒定。2.細胞免疫熒光化學檢測細胞中Ras、ERK及NF-кB表達情況;構(gòu)建過表達PAQR3慢病毒（特異性抑制Ras）,篩選MOI值轉(zhuǎn)染15例子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,設立病毒組（過表達PAQR3慢病毒）、空載組（空慢病毒載體）、空白組（同等條件下未添加任何干預）;采用RT-PCR及Western-Blot分別檢測慢病毒轉(zhuǎn)染前后Ras、ERK、NF-кB基因mRNA及蛋白表達情況;分別構(gòu)建ERK siRNA及NF-кB siRNA,轉(zhuǎn)染相同15例子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞;設立轉(zhuǎn)染組（ERK siRNA/NF-кB siRNA... 

【文章來源】：寧夏醫(yī)科大學寧夏回族自治區(qū)

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

子宮內(nèi)膜在位內(nèi)膜間質(zhì)

寧夏醫(yī)科大學碩士研究生學位論文材料與方法85min；3）將上層培養(yǎng)基棄掉，加入配置好的培養(yǎng)基，在顯微鏡下計數(shù)細胞，將細胞接種到培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中，每隔一天更換一次培養(yǎng)液，觀察細胞的生長情況。3.2免疫細胞化學鑒定間質(zhì)細胞根據(jù)不同細胞表面特異性標志分子不同進行細胞鑒定，間質(zhì)細胞為波形蛋白陽性，而腺上皮細胞為角蛋白陽性。高壓滅菌消毒的蓋玻片小心置于6孔培養(yǎng)皿，細胞計數(shù)2×104/ml后接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)6h，觀察細胞貼壁50%后，PBS清洗3次各1min，4%多聚甲醛固定15min；室溫干燥5min；PBS清洗3次各1min；加入過氧化酶阻斷劑37℃30min；PBS清洗3次各1min；非免疫性動物血清滴加后置于37℃30min；一抗孵育（PBS配波形蛋白1:500角蛋白1:50，濕盒）4℃過夜；陰性對照用PBS液；PBS清洗標本3次各1min；二抗孵育（濕盒）37℃30min；PBS清洗標本3次各1min；鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶37℃30min；PBS清洗3次各5min；DAB顯色顯微鏡下觀察呈棕色，靜置3-10min；蒸餾水洗2次1min；蘇木素復染30s；自來水洗10min；95%乙醇脫水1-2s，樹膠封片后置于顯微鏡下觀察。在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞呈現(xiàn)波形蛋白染色陽性，角蛋白陰性。波形蛋白組細胞呈梭形，核圓居中，細胞質(zhì)及細胞核均染棕黃色，波形蛋白染色陽性；角蛋白及PBS組細胞梭形，未見胞質(zhì)及胞核染色，角蛋白及PBS染色陰性。取10個不同視野進行間質(zhì)細胞計數(shù)，計算細胞純度（93±0.17）%。（見圖1）ABC圖1：子宮內(nèi)膜在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫細胞化學鑒定（×50）A:vimentin組染色陽性;B:keratin組染色陰性;C：PBS組空白對照陰性

寧夏醫(yī)科大學碩士研究生學位論文材料與方法10圖2：子宮內(nèi)膜在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫化學熒光鑒定（×50）A:vimentin熒光染色陽性;B:keratin熒光染色陰性;C：PBS空白對照陰性3.6MOI值測定生長狀態(tài)良好內(nèi)異癥間質(zhì)細胞接種于96孔板，細胞貼壁過夜，取10μl帶有GFP（GreenFluorescentProtein，綠色熒光蛋白）的空載慢病毒加90μl培養(yǎng)液，以1:100為起點進行梯度稀釋。取出過夜96孔板，棄去廢舊培養(yǎng)液，加入配置好病毒稀釋液，保留未加入病毒的細胞孔作為對照。在感染細胞后48、72、96、120h分別通過倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效果，以MOI轉(zhuǎn)染細胞80%以上為最佳MOI，結(jié)果顯示間質(zhì)細胞慢病毒轉(zhuǎn)染最佳MOI=50。3.7慢病毒轉(zhuǎn)染每皿3x105個細胞接種3.5cm培養(yǎng)皿3皿，37°5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁30-50%，每皿添加無血清培養(yǎng)基1ml進行換液，取最佳轉(zhuǎn)染MOI進行慢病毒轉(zhuǎn)染，37°5%CO2培養(yǎng)箱8-12h后，繼續(xù)添加2ml含血清培養(yǎng)基，置37°5%CO2培養(yǎng)箱，根據(jù)細胞狀態(tài)進行細胞換液，培養(yǎng)72h后觀察細胞熒光情況，后續(xù)進行細胞傳代時加入含2ug/ml嘌呤霉素進行篩選陽性克隆株。3.8siRNA干擾細胞使用無血清培養(yǎng)基細胞接種于6孔板后置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h后觀察達80%-90%融合度，將30ulLipofectamineRNAiMAX添加入1500μlOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中進行稀釋，另外，分別將8ulsiRNA加入250ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中，于室溫下，放置5min后與LipofectamineRNAiMAX緩慢輕柔的相混合，室溫下放置20min，將配制好的混合物添加入含1.5ml無血清培養(yǎng)液的6孔板中。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h后更換培養(yǎng)基，分別在12h、

【參考文獻】：
期刊論文
[1]阻斷MAPK信號通路對異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞NF-κB、Bcl-2和p21表達的影響[J]. 劉曉娟,賀英,王虹.  廣東醫(yī)學. 2015(06)
[2]子宮內(nèi)膜異位癥性不孕癥與MMP-2及性激素的關系[J]. 譚毅,黃荷鳳,朱依敏,洪麗華,張文愨.  中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志. 2002(14)



本文編號：3323362