目的:利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù),構(gòu)建穩(wěn)定敲降NF-YB基因的HeLa細(xì)胞系。方法:設(shè)計shRNA-NF-YB引物,利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T后收集病毒感染HeLa細(xì)胞;用嘌呤霉素篩選細(xì)胞得到穩(wěn)定敲降細(xì)胞株;利用Western blot和實時熒光定量PCR對細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。結(jié)果:構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)測序后與設(shè)計的引物對比序列一致,Western blot和實時熒光定量PCR結(jié)果表明構(gòu)建細(xì)胞的NF-YB蛋白和mRNA表達(dá)抑制效果明顯。結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了NF-YB-shRNA-HeLa細(xì)胞系,獲得了特異性NF-YB基因敲降的HeLa細(xì)胞。 

【文章來源】：癌變·畸變·突變. 2020,32(06)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

靶序列測序結(jié)果

q PCR檢測結(jié)果

RNA干擾技術(shù)被Jorgensen R發(fā)現(xiàn)報道，他在牽�；ㄖ袑�(dǎo)入色素合成基因后，不僅想要的色素沒有合成，插入的基因也沒有表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為共抑制[18]。直到Fire等[19]研究結(jié)果表明在導(dǎo)入了雙鏈RNA后會導(dǎo)致目的基因的特異性沉默，才將其命名為RNA干擾。2002年RNA干擾技術(shù)被Science和Nature評為重大科技成果之一，它具有高效性、高特異性等特點(diǎn)[20]。短發(fā)夾RNA(shRNA)，包含一個Loop結(jié)構(gòu)，可加工成siRNA，也可通過與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)結(jié)合序列特異性地實現(xiàn)靶mRNA降解。使用細(xì)菌或病毒載體，被導(dǎo)入靶細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，在某些情況下，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中。圖3 q PCR檢測結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3310894