發(fā)布時間：2017-04-23 11:05

  本文關(guān)鍵詞：以MMP-2為靶點的FRET探針的制備及其在宮頸癌檢測中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景宮頸癌(cervical carcinoma)是常見的婦科惡性腫瘤之一,全世界每年約有30萬女性死于宮頸癌。從宮頸上皮內(nèi)瘤變到宮頸浸潤癌約10~20年,是早期防治宮頸癌的重要階段。目前,宮頸癌的篩查方法很多,但均存在諸多缺陷。探索靈敏度高、特異性強的宮頸癌檢測和診斷方法(如價格低廉、檢測方便的熒光探針等)成為研究的熱點。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix-metalloproteinase,MMP-2)在正常宮頸上皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá),而在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸浸潤癌中高表達(dá),可用于宮頸良、惡性病變的鑒別診斷,也為探索以MMP-2為靶點的宮頸癌檢測方法奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)有的檢測MMP-2的方法均無法在活細(xì)胞或活體中進(jìn)行檢測。以MMP-2為靶點制備的Cd Te量子點探針由于毒性較大等原因而在實際應(yīng)用中受到限制。目的本研究將熒光基團(tuán)[7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸]通過能被MMP-2切割的多肽鏈(GPLGVRGKGG)連接到熒光淬滅基團(tuán){4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亞胺酯},構(gòu)建以MMP-2為靶點的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。研究其用于檢測宮頸癌細(xì)胞和宮頸癌荷瘤小鼠活體成像的可行性,為其用于宮頸癌的檢測提供科學(xué)依據(jù)。方法1.制備熒光基團(tuán)香豆酸琥珀酰亞胺活性酯。2.通過能被MMP-2切割的多肽鏈(GPLGVRGKGG)將熒光基團(tuán)[7-(二乙胺基)香豆素-3-羧酸]連接到{4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亞胺酯},制備以MMP-2為靶點的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。3.測試MMP-2、MMP-1和其他生物學(xué)相關(guān)物質(zhì)對探針的熒光響應(yīng)。4.培養(yǎng)宮頸癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa細(xì)胞,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR),實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)及Western blotting方法檢測MMP-2 m RNA和蛋白在4種不同宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)情況。5.將以MMP-2為靶點的熒光探針與宮頸癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa細(xì)胞共孵育,通過共聚焦熒光顯微鏡觀察探針對不同宮頸癌細(xì)胞的識別能力。6.構(gòu)建宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞荷瘤小鼠模型;以宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞荷瘤小鼠為研究對象,分別通過尾靜脈和瘤內(nèi)注射將以MMP-2為靶點的熒光探針注射到小鼠體內(nèi),通過活體成像儀觀察活體成像情況。結(jié)果1.制備了香豆酸琥珀酰亞胺活性酯,并通過核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,1H NMR)、核磁共振碳譜(~(13)C nuclear magnetic resonance spectrum,~(13)C NMR)和電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)表征。香豆酸琥珀酰亞胺活性酯的紫外-可見光譜最大吸收峰為445 nm。香豆酸琥珀酰亞胺活性酯為強烈的綠色熒光,熒光發(fā)射峰在480 nm處。為探針的合成奠定了基礎(chǔ)。2.構(gòu)建了以MMP-2為靶點的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針并通過基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)和高效液相色譜法(high-pressure liquid chromatography,HPLC)表征。3.熒光響應(yīng)實驗結(jié)果顯示:(1)隨著時間的增加,以MMP-2為靶點的熒光探針在480 nm的熒光強度明顯增強,增強了10倍左右并在2 h趨于平衡。(2)相關(guān)的生物學(xué)物質(zhì)如MMP-1、K~+、Mg~(2+)、Na~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)、L-絲氨酸(L-serine,L-Ser)、L-天冬氨酸(L-aspartic acid,L-Asp)、HCO_3~-、NO_3~-、ClO_4~-、F~-和Br~-對以MMP-2為靶點的熒光探針的熒光光譜沒有顯著的變化,熒光響應(yīng)不明顯。4.RT-PCR、qPCR、Western blotting結(jié)果均顯示:MMP-2在4種宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)順序是:CaSki細(xì)胞SiHa細(xì)胞C33-A細(xì)胞HeLa細(xì)胞(P0.05)。5.細(xì)胞成像結(jié)果顯示:用以MMP-2為靶點的熒光探針對宮頸癌CaSki、SiHa、C33-A和HeLa細(xì)胞進(jìn)行熒光識別,當(dāng)以MMP-2為靶點的熒光探針和宮頸癌細(xì)胞孵育2 h之后,宮頸癌細(xì)胞都表現(xiàn)出綠色熒光且其熒光強度為CaSki細(xì)胞SiHa細(xì)胞C33-A細(xì)胞HeLa細(xì)胞。6.構(gòu)建宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞荷瘤小鼠模型。活體成像結(jié)果顯示,分別將以MMP-2為靶點的熒光探針(1mM)通過尾靜脈和瘤內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)后,兩種荷瘤小鼠的瘤體均呈現(xiàn)強烈的熒光,但宮頸癌SiHa細(xì)胞荷瘤小鼠瘤體的熒光強度大于宮頸癌HeLa細(xì)胞荷瘤小鼠瘤體的熒光強度。結(jié)論1.制備了基于香豆素?zé)晒饣鶊F(tuán)的靶向MMP-2熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。2.該探針可用于宮頸癌活細(xì)胞成像和宮頸癌荷瘤小鼠體內(nèi)成像。
【關(guān)鍵詞】：宮頸癌 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針 活細(xì)胞成像 活體成像
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-30
• 2 結(jié)果30-41
• 3 討論41-44
• 4 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述：蛋白酶熒光探針在腫瘤檢測方面的應(yīng)用50-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 附錄 英文縮略詞64-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況65-66
• 致謝66-67
• 個人簡歷67

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本文編號：322279