目的:探討非催化區(qū)域酪氨酸激酶銜接蛋白1（Nck1）在宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）的血管生成中的作用及其分子機(jī)制。方法:采用免疫組織化學(xué)和免疫印跡法分別檢測CSCC標(biāo)本和癌細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。用CD34內(nèi)皮標(biāo)記結(jié)合Weinner計(jì)數(shù)法檢測癌組織微血管密度（MVD）。用實(shí)時定量PCR檢測癌細(xì)胞mRNA水平。分別通過表達(dá)質(zhì)粒pCMV2-Nck1和Nck1-siRNA轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌細(xì)胞獲得Nck1基因過表達(dá)（SiHa-Nck1+）和基因沉默（SiHa-Nck1-）的細(xì)胞株。利用ELISA檢測細(xì)胞上清液蛋白質(zhì)水平。分別通過CCK-8細(xì)胞活力測定,transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和體外Matrigel管腔實(shí)驗(yàn)分別檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的增殖、遷移和管腔形成能力。結(jié)果:Nck1的表達(dá)水平在正常宮頸上皮組織和低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變至高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變中逐漸升高。在宮頸鱗癌組織中Nck1的表達(dá)水平顯著高于高級別上皮內(nèi)瘤變,且Nck1的表達(dá)與宮頸鱗癌微血管密度正相關(guān)。與正常SiHa上清液處理后的HUVECs相比,SiHa-Nck1+上清液處理后的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和管腔形成能力顯著... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

用來自具有不同Nck1水平的SiHa細(xì)胞的上清液刺激的HUVECs的增殖，遷移和管腔形成

由于 Nck1 調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的血管生成誘導(dǎo)能力，它可能改變癌細(xì)胞中一些下游分泌性血管生成分子的表達(dá)。因此，我們評估了具有不同 Nck1 表達(dá)水平的癌細(xì)胞中一些常見血管生成分子的變化，包括 VEGF 和 MMP2。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在SiHa 細(xì)胞、SiHa-Nck+和 SiHa-Nck-之間 VEGF 的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變?nèi)鐖D3.3A。 SiHa-Nck +和 SiHa-Nck-的 MMP2 表達(dá)水平明顯高于（1.374±0.163，p <0.05）和低于（0.238±0.026，p < 0.05）SiHa 細(xì)胞（0.970±0.176，圖 3.3A）。結(jié)果表明 Nck1 可上調(diào) SiHa 細(xì)胞中 MMP2 的表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí) Nck1 對 MMP2表達(dá)的影響，用 ELISA 檢測細(xì)胞上清液 MMP2 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiHa-Nck1+的上清液 MMP2 水平（951.53±66.88 pg，p < 0.05）和 SiHa-Nck1-上清液中 MMP2的水平（652.47±56.96 pg，p < 0.05）分別顯著高于和低于 SiHa 細(xì)胞（757.77±19.30pg）（圖 3.3 B-C）。為了進(jìn)一步確認(rèn) MMP2 的促內(nèi)皮血管生成功能，使用人工重組 MMP2 蛋白直接刺激 HUVECs。如圖 3.3D-F 所示，隨著 MMP2 濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞增殖率，遷移能力和管腔形成能力增加。這些結(jié)果暗示 Nck1 介導(dǎo)的 MMP2 上調(diào)可能是 Nck1 增強(qiáng)宮頸鱗癌細(xì)胞血管誘生能力的原因。

圖 3.4 Rac1 / PAK1 信號通路在 Nck1 介導(dǎo)的 MMP2 上調(diào)和 Nck1 誘導(dǎo)的血管生成中的作用A，SiHa-Nck1+中的 Rac1-GTP，p-PAK 和 MMP2 水平顯著高于 SiHa 細(xì)胞對照組， 而SiHa-Nck1-低于 SiHa 細(xì)胞對照組（SiHa-Nck1+ vs 對照，p = 0.045，p < 0.001 和 p = 0.025；SiHa-Nck1- vs 對照，p = 0.047， p = 0.008 和 p = 0.004）。 SiHa-Nck1+用 NSC23766 處理（SiHa-Nck1 ++NSC23766）中Rac1-GTP，p-PAK1和MMP2的水平明顯低于其在SiHa-Nck+中的水平（SiHa-Nck1++NSC23766 vs SiHa-Nck1+，p = 0.003，p = 0.002 和 p = 0.012）。 B，用 PAK1 特異性抑制劑（SiHa-Nck1++IPA-3）預(yù)處理的 SiHa-Nck1+中 p-PAK1 和 MMP2 的水平顯著低于 SiHa-Nck1+（SiHa-Nck1++ IPA-3 vs SiHa-Nck1+ ，p < 0.001 和 p = 0.006）。C，用來自 SiHa-Nck1+（H-Nck1+）的上清液刺激的 HUVEC 與具有 Rac1 抑制劑處理的SiHa-Nck1+（H-Nck1+-NSC23766）和具有 PAK 抑制的 SiHa-Nck1+（H-Nck1+-IPA3）的增殖速率的比較（ *，H-Nck1+-NSC23766 vs H-Nck1+，p = 0.01； ＃，H-Nck1+-IPA-3 vsH-Nck1+，p = 0.018）。 D，H-Nck1+的遷移。 E，H-Nck1+-NSC23766 的遷移。 F，H-Nck1+-IPA-3 的遷移。 G，H-Nck1+-NSC23766 和 H-Nck1+-IPA-3 的遷移能力顯著低于H-Nck1+。 *，H-Nck1+-NSC23766 vs H-Nck1+，p = 0.02； ＃，H-Nck1+-IPA-3 vs H-Nck1+，p = 0.01。 H，H-Nck1+的管腔形成。 I，H-Nck1+-NSC23766 的管腔形成。 J，H-Nck1+-IPA-3的管腔形成。 K，H-Nck1+-NSC23766 和 H-Nck1+-IPA-3 的管形成能力明顯低于 H-Nck1+。*，H-Nck1+ -NSC23766 vs H-Nck1+，p = 0.07； ＃，H-Nck1+-IPA-3 vs H-Nck1+，p = 0.032。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3072829