卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性的生命健康。迄今為止,已有大量研究表明,天冬酰胺合成酶（ASNS）在多種類型的惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,而其在卵巢癌中的研究卻知之甚少。因此,本論文主要探討了ASNS在卵巢癌中的表達(dá)水平、作用及其表達(dá)調(diào)控研究。ASNS在哺乳動(dòng)物的器官中普遍存在,主要的生物學(xué)功能是依賴谷氨酰胺合成天冬酰胺。已有研究表明,天冬酰胺在調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)谷氨酰胺剝奪的過(guò)程中具有不可替代的作用。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞往往具有谷氨酰胺成癮性,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,谷氨酰胺代謝起著至關(guān)重要的作用。作為谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶,谷氨酰胺酶（GLS）成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。因此,GLS抑制劑的研究成為了熱點(diǎn)。我們研究發(fā)現(xiàn),GLS抑制或敲低能夠上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中的ASNS。那么,GLS與ASNS是否存在某種聯(lián)系?ASNS的表達(dá)調(diào)控是怎樣的?此外,我們已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明卵巢癌中ASNS具有促腫瘤作用,那么將天冬酰胺合成和谷氨酰胺利用雙重阻斷是否對(duì)卵巢癌有更好的治療效果?因此,我們就以上疑問(wèn)進(jìn)行探究,開(kāi)展了以下工作,獲得了一系列結(jié)果:1.ASNS在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)存在差異采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting的方法分析ASNS在卵巢癌中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示ASNS在不同的卵巢癌患者組織樣本和不同類型的卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)具有差異,說(shuō)明存在廣泛的異質(zhì)性。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出ASNS的表達(dá)水平與預(yù)后具有相關(guān)性,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果顯示ASNS低表達(dá)的卵巢癌患者無(wú)病生存期明顯延長(zhǎng)。2.ASNS在卵巢癌中發(fā)揮促腫瘤作用MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低ASNS顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖,表明ASNS在卵巢癌中發(fā)揮促腫瘤作用。而外源性補(bǔ)充天冬酰胺能夠拯救ASNS敲低引起的增殖抑制,谷氨酸不可以,說(shuō)明ASNS敲低引起的增殖抑制是由于天冬酰胺的缺乏,且天冬酰胺在卵巢癌的增殖中發(fā)揮重要的作用。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)ASNS敲低的A2780細(xì)胞G1期阻滯,而且外源性添加天冬酰胺可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象,而在HO8910細(xì)胞中ASNS敲低并未對(duì)周期產(chǎn)生影響。由于卵巢癌細(xì)胞存在異質(zhì)性,ASNS敲低抑制細(xì)胞增殖的途徑不同,ASNS敲低的A2780細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯抑制細(xì)胞增殖,而ASNS敲低的HO8910細(xì)胞的增殖抑制的機(jī)制還未明確。3.ASNS的底物谷氨酰胺水平影響其表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting的方法檢測(cè)GLS抑制劑CB-839處理后卵巢癌細(xì)胞中ASNS的表達(dá)情況,結(jié)果顯示谷氨酰胺代謝抑制后,ASNS mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。同時(shí),采用小干擾RNA敲低GLS也顯示ASNS表達(dá)升高。此外,通過(guò)無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)基處理卵巢癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn),ASNS mRNA水平升高,而蛋白水平降低,呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),分析可能的原因是,谷氨酰胺剝奪后由于氨基酸反應(yīng)激活A(yù)TF4從而誘導(dǎo)ASNS轉(zhuǎn)錄,而由于底物減少或者是蛋白合成受阻使得ASNS的蛋白水平下降。以上結(jié)果均表明,作為ASNS的關(guān)鍵底物,谷氨酰胺水平影響ASNS的表達(dá)。4.ASNS的產(chǎn)物天冬酰胺水平影響其表達(dá),而谷氨酸不影響采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting的方法檢測(cè)外源性補(bǔ)充天冬酰胺后ASNS的表達(dá)情況,結(jié)果顯示天冬酰胺水平升高后抑制ASNS表達(dá),而且外源性補(bǔ)充天冬酰胺能夠部分逆轉(zhuǎn)GLS抑制所引起的ASNS的上調(diào)。作為ASNS催化反應(yīng)的另一個(gè)產(chǎn)物,谷氨酸并不影響ASNS的表達(dá),且不能逆轉(zhuǎn)GLS抑制所引起的ASNS的上調(diào)。說(shuō)明GLS活性抑制時(shí),腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)ASNS來(lái)利用谷氨酰胺合成大量天冬酰胺。5.天冬酰胺合成和谷氨酰胺利用雙重阻斷的腫瘤抑制作用MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示ASNS敲低和GLS抑制劑聯(lián)合能夠增強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)ASNS敲低和GLS抑制劑聯(lián)合進(jìn)一步誘導(dǎo)A2780細(xì)胞G1期阻滯,而在HO8910細(xì)胞中仍未對(duì)周期產(chǎn)生影響。同時(shí),檢測(cè)ROS水平發(fā)現(xiàn)ASNS敲低和GLS抑制劑聯(lián)合誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞ROS升高。以上結(jié)果表明,卵巢癌細(xì)胞增殖抑制的途徑不同,A2780細(xì)胞的增殖抑制主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯途徑,可能部分通過(guò)誘導(dǎo)ROS升高,而HO8910細(xì)胞則可能通過(guò)誘導(dǎo)ROS升高來(lái)抑制細(xì)胞增殖�？傊�,本論文明確了ASNS在卵巢癌中的促腫瘤作用,并且表明其與預(yù)后密切相關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和天冬酰胺水平均調(diào)控ASNS的表達(dá),提出了ASNS抑制與GLS抑制聯(lián)合治療卵巢癌的可能性,從而為卵巢癌的治療提供新的方向和策略,有助于新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。




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