目的 HOXA10是胚胎黏附的重要調(diào)控分子,其表達(dá)降低將導(dǎo)致胚胎種植失敗,已知反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜組織中Nur77和HOXA10的表達(dá)均降低。本研究旨在探究Nur77是否通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)HOXA10表達(dá)參與胚胎黏附的調(diào)控。方法 1、通過熒光素酶雙報(bào)告基因、染色質(zhì)免疫共沉淀以及鏈親和素-生物素偶聯(lián)DNA沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)明確Nur77轉(zhuǎn)錄調(diào)控HOXA10的機(jī)制;2、采用腺病毒Ad-Flag-Nur77和Ad-siNur77介導(dǎo)Nur77的過表達(dá)和抑制表達(dá),并通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nur77對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞中HOXA10表達(dá)的影響;3、利用Nur77激動(dòng)劑6-MP和JAR球黏附實(shí)驗(yàn)（人胎盤絨毛癌細(xì)胞JAR細(xì)胞球黏附于Ishikawa細(xì)胞）明確HOXA10介導(dǎo)Nur77對(duì)胚胎黏附的作用。結(jié)果 熒光素酶雙報(bào)告基因、染色質(zhì)免疫共沉淀和鏈親和素-生物素偶聯(lián)DNA沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Nur77直接結(jié)合于HOXA10啟動(dòng)子區(qū)的NBRE反應(yīng)元件AAAGGTCA（-3075/-3067）,并促進(jìn) Ishikawa 細(xì)胞中 HOXA10 的轉(zhuǎn)錄。腺病毒Ad-Flag-Nur7... 

【文章來(lái)源】：南京大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１：?Ｎｕｒ７７促進(jìn)丨ｓｈｉｋａｗａ細(xì)?

我們分別構(gòu)建了含有ＮＢＲＥ位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)片斷報(bào)告基因質(zhì)粒??（ＨＯＸＡＩＯ－Ｌｕｃ）和ＮＢＲＥ位點(diǎn)缺失突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒（ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－??Ｌｕｃ）（圖２Ａ）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，外源性給予Ｎｕｒ７７腺病毒可上??調(diào)ＨＯＸＡ１０啟動(dòng)子活性達(dá)２倍以上（圖２Ｂ），但對(duì)ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－Ｌｕｃ片段的啟??動(dòng)子活性無(wú)影響（圖２Ｃ）

??為了進(jìn)一步鑒定ＨＯＸＡＩＯ是否為Ｎｕｒ７７作用的靶基因，我們進(jìn)行染色質(zhì)免??疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（ＣｈＩＰ－ＰＣＲ）。如圖３Ａ所示，利用針對(duì)ＨＯＸＡＩＯ預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)序??列的引物ＰＣＲ擴(kuò)增，可以從感染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７腺病毒的細(xì)胞免疫沉淀復(fù)合物??中，擴(kuò)增出預(yù)期大小的ＤＮＡ片段，而對(duì)照組不能擴(kuò)增出目的條帶。這表明Ｎｕｒ７７??與ＨＯＸＡＩＯ啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合。??如圖３Ｂ所示，我們合成含ＡＡＡＧＧＴＣＡ的ＨＯＸＡＩＯ啟動(dòng)子的雙鏈寡核苷??酸，且將ＡＡＡＧＧＴＣＡ突變?yōu)椋粒牵粒粒裕裕茫恋膶?duì)應(yīng)片段，用生物素標(biāo)記。收集感??染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７?（ｍｏｉ＝１００）的Ｉｓｈｉｋａｗａ細(xì)胞總蛋白，與標(biāo)記／未標(biāo)記生物素的??雙鏈寡核苷酸進(jìn)行鏈親和素免疫沉淀，結(jié)果顯示Ｎｕｒ７７與野生型（ＷＴ）片段相??１７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Regulatory Effect of Estrogen, Progestin and HB-EGF on the Expression of HOXA10 Gene in Ishikawa Cells[J]. 劉雪梅,朱桂金,鐘剛.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2007(04)



本文編號(hào)：3041463