本文關(guān)鍵詞：從p62影響RIP1泛素化的角度探討人卵巢癌耐藥的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 卵巢癌細(xì)胞耐藥是卵巢癌治療的關(guān)鍵問題，研究組前期工作發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中p62高表達(dá)，可以誘導(dǎo)自噬，自噬通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激降低了對順鉑的敏感性，從而導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對順鉑耐藥。可見腫瘤細(xì)胞的存活與死亡之間的失衡是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的主要原因。 有研究表明，NF-κB能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存，p62能夠通過與TRAF6結(jié)合參與這個(gè)過程。此外p62在結(jié)構(gòu)上存在泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域，從而能夠與K48-多聚泛素鏈和K63-多聚泛素鏈相結(jié)合，因此p62不僅可以通過自噬途徑幫助泛素化蛋白降解，也能夠通過與多聚泛素化鏈相結(jié)合，與其他開關(guān)蛋白相互作用，發(fā)揮促存活或者促凋亡的雙重作用。已有研究證實(shí)，p62與開關(guān)蛋白R(shí)IP1有相互作用位點(diǎn)。RIP1不僅能夠活化NF-κB促進(jìn)細(xì)胞的生存，也能夠活化caspase-8，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。 目的： 本實(shí)驗(yàn)從p62影響RIP1的泛素化、進(jìn)而參與NF-κB信號(hào)途徑活化的角度，，深入探討人卵巢癌細(xì)胞耐藥的機(jī)制。 方法： 以人卵巢癌細(xì)胞株即SKOV-3細(xì)胞及其子代人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株即SKOV-3/DDP細(xì)胞為研究對象，順鉑作用于兩種細(xì)胞，通過小干擾RNA抑制p62蛋白表達(dá)。利用MTT法檢測兩種細(xì)胞存活率；利用倒置光學(xué)顯微鏡及全自動(dòng)顯微鏡數(shù)碼系統(tǒng)，觀察并拍攝兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面變化；采用蛋白質(zhì)印記（Western Blot）法，提取兩種細(xì)胞總蛋白檢測RIP1、p62蛋白表達(dá)變化，提取核蛋白檢測NF-κB（p50）、NF-κB（p65）、磷酸化IκBα（p-IκBα）和IκBα蛋白表達(dá)，定量p-IκBα/IκBα蛋白比值，分析NF-κB活化情況；通過免疫熒光法，觀察細(xì)胞中NF-κB（p65）的入核情況；通過免疫共沉淀法，檢測細(xì)胞中RIP1的泛素化形式的變化。 結(jié)果： 1）與SKOV-3細(xì)胞比較， SKOV-3/DDP存活率較高，在順鉑作用24h后，部分細(xì)胞變圓顯漂浮狀態(tài)；而SKOV-3細(xì)胞幾乎全部死亡。表明SKOV-3/DDP細(xì)胞較SKOV-3細(xì)胞對順鉑有更強(qiáng)的抵抗性。 2）與SKOV-3細(xì)胞比較，p62蛋白在SKOV-3/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，順鉑作用下，p62蛋白表達(dá)水平降低；RIP1蛋白在SKOV-3/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，順鉑作用下，其變化不明顯。 3）與SKOV-3細(xì)胞比較，順鉑作用12h和24h，SKOV-3/DDP細(xì)胞核蛋白NF-κB(p50)和(p65)表達(dá)增加，p-IκBα蛋白表達(dá)增加，p-IκBα/IκBα蛋白比值增加，NF-κB(p65)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)免疫熒光增加。 4）與SKOV-3細(xì)胞比較，順鉑作用下，SKOV-3/DDP細(xì)胞RIP1的K63泛素化表達(dá)高，RIP1的K48泛素化降低，均存在時(shí)間依賴性。 5）抑制p62蛋白表達(dá)，SKOV-3/DDP細(xì)胞中的RIP1K63泛素化顯著降低，RIP1K48泛素化顯著增加，NF-κB活化程度和細(xì)胞存活率也降低。 結(jié)論： （1）在SKOV-3細(xì)胞和SKOV-3/DDP細(xì)胞中p62、RIP1蛋白表達(dá)存在差異，表明p62、RIP1可能與順鉑耐藥有關(guān)。 （2）順鉑作用下，SKOV-3/DDP細(xì)胞中RIP1的泛素化形式是決定NF-κB信號(hào)通路活性的原因之一。 （3）人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，p62可能通過調(diào)控RIP1的泛素化形式，參與活化NF-κB信號(hào)途徑,促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞耐藥的形成。
【關(guān)鍵詞】：p62 RIP1 NF-κB 泛素化 耐藥
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文縮略索引9-14
• 第1章 文獻(xiàn)綜述14-21
• 1.1 順鉑治療人卵巢癌細(xì)胞的研究進(jìn)展14-15
• 1.1.1 人卵巢癌發(fā)病特點(diǎn)14
• 1.1.2 順鉑的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)特點(diǎn)14
• 1.1.3 卵巢癌化療耐藥14-15
• 1.2 支架蛋白 p62 的結(jié)構(gòu)與功能15-16
• 1.2.1 p62 的結(jié)構(gòu)域15
• 1.2.2 p62 與 NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控15-16
• 1.3 RIP 激酶的研究進(jìn)展16-18
• 1.3.1 RIP 家族介紹16-17
• 1.3.2 RIP1 的結(jié)構(gòu)與功能17-18
• 1.4 泛素與泛素化的研究進(jìn)展18-19
• 1.4.1 泛素18
• 1.4.2 泛素化18-19
• 1.5 核因子（NF-κB）信號(hào)通路與 p6219-21
• 1.5.1 NF-κB 信號(hào)通路19
• 1.5.2 NF-κB 的信號(hào)調(diào)節(jié)因素19-21
• 第2章 實(shí)驗(yàn)部分21-45
• 2.1 引言21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 2.3.1 卵巢癌細(xì)胞及卵巢癌耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)24-25
• 2.3.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測人卵巢癌及人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞的存活率25-26
• 2.3.3 全自動(dòng)顯微鏡數(shù)碼系統(tǒng)觀察并拍攝卵巢癌及卵巢癌耐藥細(xì)胞的形態(tài)及存活情況26
• 2.3.4 Western Blot 實(shí)驗(yàn)定量分析蛋白質(zhì)變化26-28
• 2.3.5 提取細(xì)胞核蛋白28
• 2.3.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)定性分析核因子的變化28-30
• 2.3.7 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用30-31
• 2.3.8 小干擾 RNA 方法抑制 p62 蛋白的表達(dá)31-32
• 2.3.9 統(tǒng)計(jì)分析32-33
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
• 2.4.1 順鉑對 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞存活率和形態(tài)的影響33-35
• 2.4.1.1 MTT 實(shí)驗(yàn)方法檢測順鉑作用下 SKOV-3 及 SKOV-3/DDP 的存活率33-34
• 2.4.1.2 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞及 SKOV-3/DDP 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化34-35
• 2.4.2 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞及 SKOV-3/DDP 細(xì)胞 p62、RIP1 蛋白表達(dá)變化35-36
• 2.4.3 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞中 NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)的變化36-39
• 2.4.3.1 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞中 NF-κB 亞單位p50、p65 蛋白表達(dá)變化36-37
• 2.4.3.2 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞中 IκBα及 p-IκBα蛋白表達(dá)變化37-38
• 2.4.3.3 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞中 NF-κB 亞單位 p65蛋白亞細(xì)胞表達(dá)變化38-39
• 2.4.4 順鉑作用下 SKOV-3 細(xì)胞和 SKOV-3/DDP 細(xì)胞 RIP1 泛素化形式的改變39-41
• 2.4.5 構(gòu)建 p62 siRNA 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入 SKOV-3/DDP 細(xì)胞41-42
• 2.4.6 抑制 p62 的表達(dá)對順鉑作用下 SKOV-3/DDP 細(xì)胞中 RIP1 泛素化的影響42-43
• 2.4.7 抑制 p62 表達(dá)對順鉑作用下 SKOV-3/DDP 細(xì)胞 NF-κB 信號(hào)通路活性的影響43-44
• 2.4.8 抑制 p62 表達(dá)對順鉑作用下 SKOV-3/DDP 細(xì)胞存活率的影響44-45
• 第3章 討論45-48
• 第4章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果56-58
• 致謝58

【共引文獻(xiàn)】

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