目的:卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）和卵泡的體外培養(yǎng)都是治療不孕癥的很有前景的輔助生殖技術(shù)（ART）,但由于其胚胎發(fā)育潛力低,仍不是人類ART的常規(guī)技術(shù)。本研究的目的是闡明體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的可能原因,建立并完善卵泡無(wú)血清體外培養(yǎng)體系。方法:1、檢測(cè)MII時(shí)期卵母細(xì)胞線粒體功能相關(guān)指標(biāo)包括:線粒體的分布、線粒體膜電位、線粒體DNA拷貝數(shù)（mtDNA）、ROS水平。2、檢測(cè)MII時(shí)期卵母細(xì)胞細(xì)胞核相關(guān)指標(biāo)包括紡錘體組裝和染色體排列。3、檢測(cè)MII時(shí)期卵母細(xì)胞孤雌激活后產(chǎn)生鈣波的能力以及胚胎發(fā)育情況。結(jié)果:1、結(jié)果表明,具有卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)后的成熟率高于不具有卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞;與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞相比,體外成熟卵母細(xì)胞線粒體分布異常,線粒體膜電位降低,活性氧水平升高,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,無(wú)論有無(wú)卵丘細(xì)胞,這些結(jié)果在體外成熟的卵母細(xì)胞中并無(wú)差異;體外成熟卵母細(xì)胞孤雌激活后產(chǎn)生鈣離子振蕩能力和胚胎發(fā)育率顯著降低,特別是在沒(méi)有卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞體外成熟后,有近一半的卵母細(xì)胞未能在含氯化鍶的孤雌液激活中產(chǎn)生鈣波。2、我們建立了一種具有三維效果的二維卵泡無(wú)血清體外培養(yǎng)體系,該體系可以... 

【文章來(lái)源】： 李昂 山西醫(yī)科大學(xué)

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

體外培養(yǎng)成熟率和卵母細(xì)胞線粒體分布的差異A，DO和COC組第一極體排出率(MII率)，**代表兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文12異常的分布。C，三組卵母細(xì)胞線粒體分布正常與異常的比率。****代表兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:P<0.0001。比例尺，20μm。2.2體內(nèi)、外成熟的卵母細(xì)胞的線粒體膜電位差異JC-1染色用于評(píng)估線粒體膜電位時(shí)，活躍的線粒體主要分布于細(xì)胞外周，而低活性的線粒體主要分布于卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中心(圖2A)。體外成熟組（COC組與DO組）的線粒體膜電位顯著低于體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞(P<0.01)，但COC組與DO組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。圖2三組卵母細(xì)胞的線粒體膜電位差異A，顯示的是高膜電位(紅色)、低膜電位(綠色)線粒體在三組卵母細(xì)胞中的分布。B，顯示的是紅色熒光與綠色熒光相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值。**表示與CTRL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。比例尺，20μm。2.3體內(nèi)、外成熟的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平差異我們測(cè)定了三組卵母細(xì)胞中ROS的水平，在COC和DO組中活性氧的分布在細(xì)胞質(zhì)中聚集成簇(圖3A)。COC組和DO組的DCFH-DA熒光強(qiáng)度明顯高于體內(nèi)組，說(shuō)明ROS的生成增加(圖3B)。然而，在COC和DO組之間，ROS的產(chǎn)生沒(méi)有差異(圖3B)。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖3三組卵母細(xì)胞中ROS水平的差異A,通過(guò)共聚焦顯微鏡拍攝卵母細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的代表性圖像B，三組卵母細(xì)胞通過(guò)免疫熒光染色法測(cè)定ROS水平所得到的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。**代表兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。比例尺，20μm。2.4體內(nèi)、外成熟的卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)差異我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR儀比較了三組卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)(圖4)。在體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)為338958±16464，COC組卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)為433055±9732，而DO組卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)為457202±15833。獲得的數(shù)據(jù)顯示，體外成熟卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)顯著升高(P<0.01)，而COC組和DO組的mtDNA拷貝數(shù)無(wú)顯著差異，但DO組的mtDNA拷貝數(shù)呈上升趨勢(shì)。圖4三組卵母細(xì)胞的線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)差異體內(nèi)與體外的兩組（DO組與COC組）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。DO組與COC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。


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