目的哺乳動(dòng)物著床前胚胎發(fā)育、分化及胚胎基因組激活的調(diào)控機(jī)制是生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題之一。研究著床前胚胎基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,對(duì)于深入認(rèn)識(shí)著床前胚胎發(fā)育過(guò)程,提高人類輔助生殖助孕技術(shù)的成功率,揭示不孕與不育、出生缺陷及某些遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)理有重要意義。由于小鼠基因組和人類基因組具有廣泛的同源性;同時(shí),小鼠胚胎和人類胚胎具有許多共同的特征。因此,對(duì)于小鼠胚胎發(fā)育的研究,可以幫助人們深入認(rèn)識(shí)人類胚胎發(fā)育的過(guò)程。近年研究發(fā)現(xiàn),mir-290簇在小鼠著床前胚胎中特異性高表達(dá),但其對(duì)小鼠著床前胚胎發(fā)育的具體作用和調(diào)控機(jī)理仍未闡明。近期數(shù)據(jù)顯示,microRNA可通過(guò)靶向自噬相關(guān)基因參與調(diào)控細(xì)胞自噬水平,介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)對(duì)饑餓、生長(zhǎng)因子缺失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和病原體感染等應(yīng)激環(huán)境。自噬是細(xì)胞分解代謝的重要生理過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,自噬在卵母細(xì)胞向受精卵轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮了降解母源性物質(zhì)、提供氨基酸能量和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用。有學(xué)者在對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的研究中,發(fā)現(xiàn)mir-290簇可靶向作用于自噬相關(guān)基因Atg7和ULK1,抑制腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡。但是,在小鼠著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中,mir-290簇是否... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：95 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

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前言
文獻(xiàn)回顧
第一部分 miR-291a/b-5p在小鼠著床前胚胎發(fā)育的表達(dá)及Atg5和Becn1在著床前胚胎中的動(dòng)態(tài)變化
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊試劑配制與移卵針制備
        2.2 小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞與著床前胚胎的采集
        2.3 Real Time PCR
        2.4 小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞與著床前胚胎的免疫熒光檢測(cè)
        2.5 小鼠著床前胚胎透射電鏡標(biāo)本的制備與檢測(cè)
        2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與圖形分析
    3 結(jié)果
        3.1 miR-291a/b-5p在小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞和著床前胚胎中的表達(dá)
        3.2 Atg5和Becn1在小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞和著床前胚胎中的表達(dá)
        3.3 在小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞和著床前胚胎中，miR-291a/b-5p與自噬相關(guān)基因Atg5和Becn1動(dòng)態(tài)表達(dá)的對(duì)應(yīng)關(guān)系
        3.4 免疫熒光檢測(cè)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞和著床前胚胎中自噬的動(dòng)態(tài)變化
        3.5 透射電鏡檢測(cè)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞和受精卵中自噬的變化
    4 討論
第二部分 miR-291a/b-5p通過(guò)靶向Atg5和Becn1抑制NIH/3T3細(xì)胞自噬體形成
    1 材料
    2 方法
        2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        2.3 雙熒光素酶活性檢測(cè)
        2.4 Real Time PCR檢測(cè)
        2.5 Western blot檢測(cè)
        2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與圖形分析
    3 結(jié)果
        3.1 miR-291a/b-5p靶向Atg5和Becn1序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果
        3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因載體測(cè)序結(jié)果
        3.3 Luciferase Assay檢測(cè)miR-291a/b-5p對(duì)Atg5和Becn1的靶向作用
        3.4 過(guò)表達(dá)miR-291a/b-5p對(duì)Atg5和Becn1 mRNA表達(dá)的影響
        3.5 過(guò)表達(dá)miR-291a/b-5p對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后NIH/3T3細(xì)胞中Atg5和Becn1蛋白表達(dá)的影響
        3.6 過(guò)表達(dá)miR-291a/b-5p對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后NIH/3T3細(xì)胞自噬體形成的影響
    4 討論
第三部分 抑制miR-291a-5p對(duì)小鼠著床前胚胎Atg5和Becn1表達(dá)及早期胚胎發(fā)育的影響
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊試劑配制
        2.2 小鼠 1-cell期胚胎的獲取和采集
        2.3 小鼠 1-cell期胚胎的胞漿顯微注射和體外培養(yǎng)
        2.4 Real Time PCR
        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 胞漿顯微注射后miR-291a-5p inhibitor在小鼠著床前胚胎中的表達(dá)
        3.2 胞漿顯微注射miR-291a-5p inhibitor對(duì)miR-291a-5p的抑制效應(yīng)及其對(duì)Atg5和Becn1mRNA表達(dá)的影響
        3.3 胞漿顯微注射miR-291a-5p inhibitor對(duì)小鼠著床前胚胎發(fā)育的影響
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果
致謝



本文編號(hào)：2947802