目的哺乳動物著床前胚胎發(fā)育、分化及胚胎基因組激活的調控機制是生殖醫(yī)學研究領域的難點和熱點問題之一。研究著床前胚胎基因表達調控機制,對于深入認識著床前胚胎發(fā)育過程,提高人類輔助生殖助孕技術的成功率,揭示不孕與不育、出生缺陷及某些遺傳性疾病的發(fā)病機理有重要意義。由于小鼠基因組和人類基因組具有廣泛的同源性;同時,小鼠胚胎和人類胚胎具有許多共同的特征。因此,對于小鼠胚胎發(fā)育的研究,可以幫助人們深入認識人類胚胎發(fā)育的過程。近年研究發(fā)現(xiàn),mir-290簇在小鼠著床前胚胎中特異性高表達,但其對小鼠著床前胚胎發(fā)育的具體作用和調控機理仍未闡明。近期數(shù)據(jù)顯示,microRNA可通過靶向自噬相關基因參與調控細胞自噬水平,介導細胞應對饑餓、生長因子缺失、內質網應激和病原體感染等應激環(huán)境。自噬是細胞分解代謝的重要生理過程。在胚胎發(fā)育過程中,自噬在卵母細胞向受精卵轉化過程中發(fā)揮了降解母源性物質、提供氨基酸能量和維持細胞內穩(wěn)態(tài)的重要作用。有學者在對小鼠黑色素瘤細胞的研究中,發(fā)現(xiàn)mir-290簇可靶向作用于自噬相關基因Atg7和ULK1,抑制腫瘤細胞的自噬性死亡。但是,在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中,mir-290簇是否... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：博士

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前言
文獻回顧
第一部分 miR-291a/b-5p在小鼠著床前胚胎發(fā)育的表達及Atg5和Becn1在著床前胚胎中的動態(tài)變化
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊試劑配制與移卵針制備
        2.2 小鼠MⅡ期卵母細胞與著床前胚胎的采集
        2.3 Real Time PCR
        2.4 小鼠MⅡ期卵母細胞與著床前胚胎的免疫熒光檢測
        2.5 小鼠著床前胚胎透射電鏡標本的制備與檢測
        2.6 統(tǒng)計學分析與圖形分析
    3 結果
        3.1 miR-291a/b-5p在小鼠MⅡ期卵母細胞和著床前胚胎中的表達
        3.2 Atg5和Becn1在小鼠MⅡ期卵母細胞和著床前胚胎中的表達
        3.3 在小鼠MⅡ期卵母細胞和著床前胚胎中，miR-291a/b-5p與自噬相關基因Atg5和Becn1動態(tài)表達的對應關系
        3.4 免疫熒光檢測小鼠MⅡ期卵母細胞和著床前胚胎中自噬的動態(tài)變化
        3.5 透射電鏡檢測小鼠MⅡ期卵母細胞和受精卵中自噬的變化
    4 討論
第二部分 miR-291a/b-5p通過靶向Atg5和Becn1抑制NIH/3T3細胞自噬體形成
    1 材料
    2 方法
        2.1 雙熒光素酶報告基因載體構建
        2.2 細胞培養(yǎng)與轉染
        2.3 雙熒光素酶活性檢測
        2.4 Real Time PCR檢測
        2.5 Western blot檢測
        2.6 統(tǒng)計學分析與圖形分析
    3 結果
        3.1 miR-291a/b-5p靶向Atg5和Becn1序列的生物信息學分析結果
        3.2 雙熒光素酶報告基因載體測序結果
        3.3 Luciferase Assay檢測miR-291a/b-5p對Atg5和Becn1的靶向作用
        3.4 過表達miR-291a/b-5p對Atg5和Becn1 mRNA表達的影響
        3.5 過表達miR-291a/b-5p對雷帕霉素誘導自噬后NIH/3T3細胞中Atg5和Becn1蛋白表達的影響
        3.6 過表達miR-291a/b-5p對雷帕霉素誘導自噬后NIH/3T3細胞自噬體形成的影響
    4 討論
第三部分 抑制miR-291a-5p對小鼠著床前胚胎Atg5和Becn1表達及早期胚胎發(fā)育的影響
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊試劑配制
        2.2 小鼠 1-cell期胚胎的獲取和采集
        2.3 小鼠 1-cell期胚胎的胞漿顯微注射和體外培養(yǎng)
        2.4 Real Time PCR
        2.5 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 胞漿顯微注射后miR-291a-5p inhibitor在小鼠著床前胚胎中的表達
        3.2 胞漿顯微注射miR-291a-5p inhibitor對miR-291a-5p的抑制效應及其對Atg5和Becn1mRNA表達的影響
        3.3 胞漿顯微注射miR-291a-5p inhibitor對小鼠著床前胚胎發(fā)育的影響
    4 討論
小結
參考文獻
個人簡歷和研究成果
致謝



本文編號：2947802