MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為19~23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,經(jīng)過加工后,通過完全配對或者不完全配對的方式結(jié)合到相對應的靶基因3’非翻譯區(qū),發(fā)揮了降解靶基因或者抑制靶基因翻譯的作用,從而調(diào)控靶基因的表達,是基因表達調(diào)控研究領(lǐng)域的一個重大突破。miRNA作為生物體生長發(fā)育過程中的重要調(diào)控基因,目前對其研究主要方向是探查mi RNAs與各種重大疾病的發(fā)表機制、預后及治療的關(guān)系,例如與生長發(fā)育異常的關(guān)系,與遺傳或免疫疾病的關(guān)系,還有與腫瘤的關(guān)系。子宮頸癌(cervcial carcinoma,CC)是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第二位。中國每年新發(fā)病例達13.15萬,死亡人數(shù)每年約5.3萬,是危害我國女性生殖健康與生命的重要疾病。宮頸癌的病理類型多種多樣,鱗狀細胞癌是最常見的,約占總體的85%,腺癌排第二約占10~15%,鱗腺癌3%,目前還發(fā)現(xiàn)一些特殊的病理類型如神經(jīng)內(nèi)分泌癌、小細胞癌和小圓細胞癌、透明細胞癌等,惡性程度較前3種類型高[3]。相同臨床分期的宮頸癌患者的預后仍有不同差別,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期宮頸癌患者經(jīng)過規(guī)范治療通常預后很好,五年生存率可達80~90%,而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相同臨床分期患者五年生存率則下降至40~50%。一旦被診斷宮頸癌,對患者的家庭,社會經(jīng)濟和衛(wèi)生資源的消耗都有較大影響。宮頸疾病的三階梯篩查準則在宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)中起了重要作用,使得宮頸癌的早期診斷率得以顯著提高。但是在發(fā)展中國家,特別是落后邊境地區(qū),由于保健意識欠缺及經(jīng)濟條件落后,導致了診斷宮頸癌時已是晚期,失去了根治性手術(shù)治療,或根治性放療的時機。因此,宮頸癌的早期診斷和治療的研究一直是我國婦科腫瘤學研究的重點。宮頸癌的治療策略仍是以手術(shù)及放射治療為主,對放療不敏感、復發(fā)以及中晚期的患者,則采取輔助性治療或姑息性的化學藥物治療或者靶向治療。本課題組先前進行的研究,通過分析宮頸鱗癌患者的血清及組織標本的miRNA表達譜,篩選出組織及血清樣本中均呈高表達的miRNA有miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p、miR-4484。miR-1246在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌患者的癌組織和血清中都存在趨勢一致的特異性升高,通過統(tǒng)計分析miR-1246在血清標本中識別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的特異度為86.0%,ROC曲線下面積為84.7%。提示miR-1246可能在鱗狀細胞癌這一病理類型中存在普遍的特異性高表達,可能成為類似SCC這樣的血清標記物用于判斷宮頸鱗癌患者的病情。并且通過生物信息學手段和生物實驗證實,thrombospondin-2(THBS2)基因序列中存在mi R-1246的靶點,并證明THBS2是miR-1246的一個靶基因。THBS2是血小板反應蛋白家族中的一員,THBS2具有金屬基質(zhì)轉(zhuǎn)移酶(MMPs)的結(jié)合位點,可協(xié)同其他基因調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的水解作用,調(diào)節(jié)細胞的粘附和遷移力。推測THBS2可能通過調(diào)節(jié)MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)和ECM(細胞外基質(zhì)),起到抑制腫瘤血管生成的作用。本研究的主要目的是探討慢病毒介導的miR-1246表達下調(diào)對宮頸癌細胞系SiHa增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學特性的影響以及其對下游蛋白THBS2/MMPs/ECM的影響,為以miR-1246及其靶基因為靶點的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。并通過分析miR-1246的靶基因THBS2與宮頸癌臨床病例病理特征和預后的關(guān)系,初步分析THBS2表達在宮頸癌中的作用,以期為宮頸癌的臨床診斷、治療和隨訪途徑提供更多的思路。第一部分下調(diào)miR-1246表達對宮頸癌SiHa細胞增殖力,凋亡率和侵襲力的的影響1、下調(diào)體外培養(yǎng)的宮頸癌SiHa細胞的miR-1246表達,觀察宮頸癌SiHa細胞增殖,凋亡率和侵襲力的改變目的:檢測下調(diào)miR-1246表達對宮頸癌SiHa細胞侵襲力和凋亡率的能力的影響。方法:構(gòu)建抑制miR-1246表達的慢病毒表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒,包裝慢病毒,感染宮頸癌SiHa細胞,使該細胞的miR-1246穩(wěn)定下調(diào)表達。實驗設(shè)三組:空白對照組(SiHa,Blank組)、陰性對照組(感染了攜帶綠色熒光表達質(zhì)粒的重組慢病毒,稱LV-NC)與miR-1246表達下調(diào)組(感染了攜帶miR-1246-Inhibitor表達質(zhì)粒和綠色熒光的重組慢病毒,稱為LV-miR-1246-Inh),在體外觀察mi R-1246-Inh對SiHa細胞增殖及凋亡的影響。通過細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線、CCK8法檢測增殖抑制率,利用Annexin V/7-ADD雙染色法及流式細胞儀檢測細胞凋亡率及細胞周期分布情況。Transwell侵襲和遷移實驗比較不同處理組細胞的侵襲力。結(jié)果:重組慢病毒LV-miR-1246-Inh可有效下調(diào)SiHa細胞內(nèi)miR-1246的表達水平。細胞生長曲線和CCK8檢測結(jié)果提示,LV-miR-1246-Inh組宮頸癌SiHa細胞的增殖速度低于空白對照組和陰性對照組,表明miR-1246表達下調(diào)可以抑制宮頸癌SiHa細胞的生長。流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率提示,LV-miR-1246-Inh組的宮頸癌細胞平均凋亡率高于其余兩個對照組。流式細胞周期分析提示,與對照組相比,miR-1246表達下調(diào)出現(xiàn)細胞周期阻滯于G0/G1期,S期比率增加。這些結(jié)果表明,體外實驗中,miR-1246表達下調(diào)可抑制宮頸癌細胞的增殖,促進細胞凋亡,推測miR-1246在宮頸癌中發(fā)揮促進腫瘤進展的作用。結(jié)論:miR-1246表達下調(diào)可抑制人宮頸癌細胞系SiHa的增殖,阻滯細胞周期,減弱腫瘤細胞的侵襲力。2、miR-1246下調(diào)表達的體內(nèi)實驗研究目的:探討miR-1246表達下調(diào)對SiHa細胞在體內(nèi)腫瘤形成能力的抑制。方法:篩選穩(wěn)定miR-1246表達下調(diào)的宮頸癌SiHa細胞,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。觀察抑制瘤生長曲線,計算抑瘤率。結(jié)果:LV-miR-1246-Inh組與對照組相比,成瘤時間晚,腫瘤生長緩慢,實驗組腫瘤體積小于對照組,有統(tǒng)計學差異。結(jié)論:miR-1246表達下調(diào)可抑制移植瘤的生長。第二部分miR-1246對THBS2/MMPs信號途徑的影響1、探討miR-1246對THBS2信號途徑的作用目的:研究miR-1246影響宮頸癌SiHa細胞增殖及侵襲能力的內(nèi)在分子機制是否通過THBS2信號途徑調(diào)節(jié)。方法:取空白對照組、陰性對照組(LV-NC)與miR-1246抑制組(LV-miR-1246-Inh)移植瘤組織,利用實時定量PCR及western blot檢測THBS2及其下游基因MMP2,MMP9和ECM的mRNA及蛋白表達情況。結(jié)果:1.LV-miR-1246-Inh組中,THBS2 mRNA及蛋白表達水平最高,與對照組相比有統(tǒng)計學差異;2、內(nèi)源性下調(diào)miR-1246水平后,THBS2相關(guān)基因MMP2、MMP9表達下降,而ECM表達上調(diào)。結(jié)論:通過分析移植瘤組織中THBS2及其相關(guān)基因的表達,提示重組慢病毒LV-miR-1246-Inh可以使得THBS2表達上調(diào),THBS2表達上調(diào)同時其相關(guān)的基因表達同時改變。第三部分宮頸癌組織中THBS2的表達與臨床病理特征和預后的關(guān)系目的:研究宮頸癌患者的組織標本中THBS2的表達與臨床病理特征、預后的關(guān)系。方法:收集52例新鮮人宮頸癌組織標本,利用q RT-PCR技術(shù)檢測THBS2 mRNA的相對表達量,Western Blot檢測THBS2蛋白表達水平,分析THBS2表達與臨床病理特征的關(guān)系。通過隨訪,分析THBS2表達與宮頸癌預后的關(guān)系。結(jié)果:宮頸癌組織中的THBS2表達量低于正常宮頸組織,有統(tǒng)計學差異(p0.05),THBS2的低表達與宮頸癌宮旁浸潤、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。THBS2盡管不是影響宮頸癌預后的獨立因子,但是高表達者的生存期優(yōu)于低表達者。結(jié)論:THBS2低表達提示宮頸癌不良預后�？偨Y(jié):1.用感染重組慢病毒的方法在宮頸癌細胞中穩(wěn)定下調(diào)miR-1246的表達在體內(nèi)外均可以抑制宮頸癌細胞SiHa生長,抑制其浸潤轉(zhuǎn)移。2.mi R-1246表達下調(diào)后可以負調(diào)節(jié)靶基因THBS2表達,使其表達水平上調(diào),并且導致THBS2下游相關(guān)基因MMP2、MMP9、ECM的表達改變,從而抑制了宮頸癌SiHa細胞的增殖能力和侵襲力。3.宮頸癌組織中THBS呈低表達狀態(tài);THBS2低表達者生存期較高表達者短,提示THBS2低表達與宮頸癌惡性生長及不良預后有關(guān),有望成為判斷宮頸癌預后的標記物和基因輔助治療的靶點。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

毒轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細胞株 293T 和大腸桿菌 DH．5a由廣西醫(yī)科大學腫瘤驗研究部保存；雌性 BaLb／c 裸鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，4- 周齡，體重（14 士 2）g，實驗計劃經(jīng)廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會準。.4.2 慢病毒包裝系統(tǒng)采用商業(yè)化的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，三質(zhì)粒系統(tǒng)，由慢病毒 達 載 體 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFR-puro 以 及 pHelper1.0 載 體 和Helper2.0 載體這兩種結(jié)構(gòu)、包裝質(zhì)粒組成，表達載體采用 U6 啟動子，含原核生物篩選抗性氨芐青霉素和真核生物篩選抗性（嘌呤霉素），同時含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達原件。慢病毒載體包裝、感染細胞后可穩(wěn)定下調(diào)表達 miR-1246（以下簡稱為 LV-miR-246Inh）。

圖 1-2 轉(zhuǎn)染前 293T 細胞密度（200 倍）Fig1-2 293T cell before infection提高轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染前 2 h 最好更換為無血清培養(yǎng)基；混合物的預先混合，在滅菌離心管中加入重組載體質(zhì)Inh，及含對照序列的質(zhì)粒）20 μg、pHelper 1.0 載體質(zhì)粒0 載體質(zhì)粒 10 μg ，以及相應體積吉凱專用轉(zhuǎn)染n2000 混合均勻，總體積約 1ml，在室溫下靜置孵育 15 m染混合物緩慢滴加至 293T 細胞培養(yǎng)液中，輕柔晃動培過程一定要輕柔且均勻，盡可能地不要將細胞吹起。放入培養(yǎng) 6~12 小時。養(yǎng) 6 h 后將含有轉(zhuǎn)染混和物的無血清培養(yǎng)基更換為常規(guī)棄無血清培養(yǎng)基后 PBS 液清洗細胞表面一次，加入含

圖 1-3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后 293T GFP表達Fig1-3 GFP showed in 293T cell after transfection慢病毒毒液的收獲及濃縮) 轉(zhuǎn)染 24h 后收集細胞上清液至離心管，4℃、3000 轉(zhuǎn)離心 10 mi胞碎片；用 0.45 μm 的無菌濾器過濾并收集濾液。培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)的含血清 DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染 72h 后可再一次收集上清液（病)將含有病毒顆粒的上清液約 40ml 轉(zhuǎn)移到超速離心管，于低溫超速, 4℃，25000 rpm，離心 2 h。) 離心結(jié)束后，棄去上清，適當干燥，加入病毒保存液，反復輕柔；經(jīng)充分溶解后，4℃高速離心 10000 rpm、5min，收集上清按要
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本文編號：2872884