第一部分:含銅宮內(nèi)節(jié)育器(Copper Intrauterine Device,Cu-IUD)對(duì)獼猴子宮內(nèi)膜的影響【目的】構(gòu)建獼猴含銅宮內(nèi)節(jié)育器(Copper Intrauterine Device,Cu-IUD)置入模型,分析置器后不同月經(jīng)周期獼猴宮腔液Cu~(2+)濃度、血清雌孕激素水平、子宮內(nèi)膜出血相關(guān)因子的表達(dá)水平及組織病理變化,為研究Cu-IUD致子宮內(nèi)膜異常出血的機(jī)制奠定基礎(chǔ)�！痉椒ā窟x取成年雌性獼猴12只,其中Cu-IUD組9只,對(duì)照組3只。Cu-IUD組通過(guò)手術(shù)置入Cu-IUD(按人與動(dòng)物體重劑量折算方法,以正常人體置入的宮內(nèi)節(jié)育器的含銅表面積220 mm2為依據(jù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需的材料大小),對(duì)照組僅作子宮切口處理。術(shù)后待觀察到獼猴的一個(gè)完整的月經(jīng)周期后,分別在下一個(gè)月經(jīng)周期的月經(jīng)期(月經(jīng)周期第2天)、增生期(月經(jīng)周期第10天)和分泌期(月經(jīng)周期第20天)收集兩組獼猴的宮腔沖洗液、動(dòng)脈血及子宮內(nèi)膜組織。其中,Cu-IUD組不同月經(jīng)周期各取3只獼猴,對(duì)照組不同月經(jīng)周期各取1只獼猴。通過(guò)火焰原子吸收光譜法(Flame atomic absorption spectrometry,FAAS)檢測(cè)兩組獼猴不同月經(jīng)周期宮腔沖洗液中的Cu~(2+)濃度;蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)分析子宮內(nèi)膜損傷情況;酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)雌孕激素水平;RT-q PCR及Western Blot分別檢測(cè)環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOs)的表達(dá)�！窘Y(jié)果】FAAS結(jié)果顯示Cu-IUD組不同月經(jīng)周期Cu~(2+)濃度均明顯高于對(duì)照組(P0.05),其中,月經(jīng)期差異最大;HE結(jié)果顯示Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜損傷較對(duì)照明顯,增生期和分泌期未見(jiàn)明顯差異;ELISA結(jié)果顯示Cu-IUD組不同月經(jīng)周期雌孕激素水平與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差異;Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜COX-2、VEGF、NOS m RNA及蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P0.05),增生期和分泌期未見(jiàn)明顯差異。【結(jié)論】置入Cu-IUD后獼猴月經(jīng)期宮腔液中Cu~(2+)的釋放顯著增加,并導(dǎo)致月經(jīng)期子宮內(nèi)膜損傷加重及出血相關(guān)因子的表達(dá)水平增高,但不影響血清雌孕激素水平。第二部分:Cu-IUD致獼猴子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)通路的初步探索【目的】研究置入Cu-IUD后子宮內(nèi)膜組織中基因表達(dá)譜的變化,并初步探索其參與的子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路。【方法】分別提取Cu-IUD組和對(duì)照組不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜組織的RNA,進(jìn)行二代高通量測(cè)序,篩選兩組月經(jīng)期差異表達(dá)的m RNA并應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析這些差異m RNA參與的生物學(xué)過(guò)程及分子功能;RT-q PCR對(duì)上述部分差異m RNA進(jìn)行驗(yàn)證并篩選靶標(biāo)m RNA;Western Blot對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)m RNA進(jìn)一步驗(yàn)證并通過(guò)Western Blot及免疫組化檢測(cè)其相關(guān)的上、下游基因的表達(dá)水平,探究Cu-IUD致異常出血可能涉及的通路�！窘Y(jié)果】高通量測(cè)序結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜共有953個(gè)差異表達(dá)的基因,其中上調(diào)的有425個(gè),下調(diào)的有528個(gè);生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示上述部分基因參與了出血損傷、Cu~(2+)代謝、組織修復(fù)等相關(guān)過(guò)程,通過(guò)RT-q PCR驗(yàn)證得到的靶標(biāo)差異基因?yàn)?MMP1、MMP2、MMP9、MMP14、MT1A、MT1L、TGF-β1、TGF-β3;Western Blot結(jié)果顯示Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織中MMP1、MMP2、MMP9、MMP14的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P0.05),MT的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P0.05),TGF-β1的蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P0.05),上述結(jié)果與RT-q PCR一致;此外,Western Blot及免疫組化結(jié)果顯示Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織中TSP1(TGF-β上游基因)的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P0.05),P-SMAD2/3((TGF-β下游基因))的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P0.05);Cu-IUD組月經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織中P-P65(磷酸化NF-κB,MMPs上游基因)的蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P0.05)�！窘Y(jié)論】Cu-IUD可顯著影響子宮內(nèi)膜組織中出血損傷、Cu~(2+)代謝、組織修復(fù)等相關(guān)基因m RNA及蛋白的表達(dá)水平,且可能參與子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的相關(guān)信號(hào)通路:NF-κB/MMPs(損傷通路)及TSP1/TGF-βs/SMAD2/3(修復(fù)通路)。第三部分:NF-κB及TGF-β信號(hào)通路參與Cu-IUD致人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(HEEC)損傷/修復(fù)的研究【目的】體外探索NF-κB及TGF-β信號(hào)通路參與Cu-IUD致子宮內(nèi)膜損傷/修復(fù)的機(jī)制。【方法】選擇HEEC作為研究對(duì)象,培養(yǎng)液中添加Cu~(2+)進(jìn)行處理,通過(guò)CCK-8法檢測(cè)Cu~(2+)處理組和未處理組的細(xì)胞活力,確定合適的Cu~(2+)濃度,并通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)確定Cu~(2+)對(duì)HEEC損傷修復(fù)是否有影響;通過(guò)Western Blot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Cu~(2+)處理組和未處理組中損傷修復(fù)相關(guān)基因MMP1、MMP2、MMP9、TGF-β1、P-P65、P65、P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3及TPS-1蛋白表達(dá)水平的差異;在上述基因的表達(dá)水平存在差異的情況下,通過(guò)干擾P-P65或者TGF-β1探索Cu-IUD致HEEC損傷修復(fù)的相關(guān)通路:(1)損傷通路:在Cu~(2+)處理的情況下,實(shí)驗(yàn)組HEEC培養(yǎng)液中添加不同濃度的NF-κB抑制劑(QNZ),Western Blot檢測(cè)P-P65、MMP9的蛋白表達(dá)水平,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)最適濃度下HEEC的損傷修復(fù)情況,(2)修復(fù)通路:在Cu~(2+)處理的情況下,實(shí)驗(yàn)組HEEC培養(yǎng)液中添加不同濃度細(xì)胞因子TGF-β1,Western Blot檢測(cè)P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3的蛋白表達(dá)水平,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)最適濃度下HEEC的損傷修復(fù)情況。【結(jié)果】5μg/ml的Cu~(2+)處理HEEC 48小時(shí)后,細(xì)胞的增殖活力大約為對(duì)照組的50%,且劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5μg/ml的Cu~(2+)處理修復(fù)率顯著低于對(duì)照組(P0.05);Cu~(2+)處理HEEC后MMP1、MMP2、MMP9、P-P65的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P0.05),TGF-β、P-SMAD2,P-SMAD3及TSP1的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P0.05);在Cu~(2+)處理的情況下,添加QNZ(100 n M)后,P-P65、MMP9的蛋白表達(dá)水平明顯降低,且HHEC的損傷修復(fù)率顯著提高;添加TGF-β1(10 ng/ml)后,P-SMAD2,P-SMAD3的蛋白表達(dá)水平明顯升高,且HHEC的損傷修復(fù)率顯著提高。【結(jié)論】Cu~(2+)可引起HHEC中MMPs、P-P65蛋白表達(dá)水平的上調(diào)及TGF-β的蛋白表達(dá)水平的下調(diào),且可能通過(guò)激活NF-κB/MMP9信號(hào)通路(損傷通路)及抑制TSP1/TGF-β/SMAD2/3信號(hào)通路(修復(fù)通路)從而抑制HEEC的增殖修復(fù)作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R711
【部分圖文】：

以上結(jié)果均提示置器后月經(jīng)期 Cu2+代謝速率（損傷保護(hù)性因素）降上所述，目前對(duì)置入 Cu-IUD 后子宮異常出血的機(jī)制研究主要集中在的子宮內(nèi)膜損傷。然而，子宮內(nèi)膜的周期性變化本身就是損傷與增殖。因此，單從損傷角度，仍不能完整解釋異常出血的發(fā)生機(jī)制。孕激素與損傷/增殖修復(fù)宮內(nèi)膜上皮的生長(zhǎng)受雌、孕激素的調(diào)控呈現(xiàn)周期性變化，月經(jīng)規(guī)則入 Cu-IUD 后，其血清激素水平不會(huì)隨著 IUD 的置放而發(fā)生改變[21]。Cu-IUD導(dǎo)致的子宮異常出血等不良反應(yīng)與激素調(diào)控的子宮內(nèi)膜周期不存在直接的相關(guān)性。且置器后主要影響的是月經(jīng)期，表現(xiàn)為出血量延長(zhǎng)等，而在增生期和分泌期很少見(jiàn)到異常出血的發(fā)生。于以上事實(shí)，我們推測(cè)：置器后受激素調(diào)控的子宮內(nèi)膜周期性變化 Cu2+的刺激，子宮出血的模式發(fā)生改變（置器后月經(jīng)周期中子宮內(nèi)膜出血關(guān)系圖 3）。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 放置 Cu-IUD 后獼猴不同月經(jīng)周期宮腔液中 Cu2+的濃度我們采用 FAAS 法測(cè)定不同月經(jīng)時(shí)期的宮腔溶液中 Cu2+的濃度，結(jié)果顯u-IUD 組不同月經(jīng)周期宮腔沖洗液中 Cu2+的濃度均明顯高于對(duì)照組（P＜0.0月經(jīng)期差異最大。此外，Cu-IUD 組中月經(jīng)期宮腔沖洗液中的 Cu2+濃度明顯增生期和分泌期高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 4）。上述結(jié)果表入含銅宮內(nèi)節(jié)育器后，月經(jīng)期 Cu2+釋放明顯增加，很可能是導(dǎo)致月經(jīng)出血的直接原因。

圖 2 置入 Cu-IUD 后對(duì)不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜形態(tài)的影響（標(biāo)尺=100 μm）3.3 放置 Cu-IUD 后對(duì)獼猴不同月經(jīng)周期雌孕激素的影響我們通過(guò) ELISA 的方法分別檢測(cè) Cu-IUD 組和對(duì)照組獼猴血清激素的改變。結(jié)果顯示Cu-IUD組獼猴不同月經(jīng)周期血清雌孕激素水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）（表 1）。結(jié)果提示含銅共內(nèi)節(jié)育器并不是通過(guò)影響激素的變化而導(dǎo)致月經(jīng)期子宮內(nèi)膜出血加重的。表 1. Cu-IUD 對(duì)雌性獼猴不同月經(jīng)周期血清激素的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）PhaseE2 (pg/ml) P (ng/ml)Cu Control Cu ControlMenstrual 59.3±21.1 68.3±25.9 0.457±0.318 0.447±0.17Proliferative 107±16.5 112±26.2 0.301±0.121 0.327±0.13Secretory 131±22 137.3±23.4 7.837±4.016 6.887±2.175
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 ;12萬(wàn)例宮內(nèi)節(jié)育器避孕效果調(diào)查報(bào)告[J];人口與計(jì)劃生育;2007年09期

2 狄海紅;朱長(zhǎng)虹;謝長(zhǎng)生;夏先平;甄波;劉子龍;;納米銅復(fù)合材料宮內(nèi)節(jié)育器對(duì)家兔子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)的影響[J];生殖與避孕;2006年10期

3 甄波;朱長(zhǎng)虹;謝長(zhǎng)生;劉子龍;蔡水洲;沈婭;狄海紅;劉合芳;;納米銅/聚合物復(fù)合材料宮內(nèi)節(jié)育器對(duì)獼猴宮腔液t-PA、PAF、PGE_2水平的影響[J];生殖與避孕;2006年08期

4 陳和平,劉鋒,吳尚純,鄒孟紅,仝昭瑾,宋思,程渭玉,王素貞,潘欽瑞;宮內(nèi)節(jié)育器宮腔形Cu300、TCu220C、TCu380A放置10年的臨床比較性研究[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2003年05期

本文編號(hào)：2869040