背景和研究目的:陰道微生態(tài)環(huán)境的菌群種類改變或數(shù)量失衡可引起多種陰道疾病。目前臨床上針對(duì)細(xì)菌性陰道感染疾病的治療手段主要是采用抗生素治療,而抗生素治療可顯著改變陰道的微生態(tài)環(huán)境并造成菌群失調(diào),從而導(dǎo)致治療效果不佳、復(fù)發(fā)率高等問題。大量研究表明,人體的健康狀態(tài)與腸道菌群密切相關(guān),且腸道益生菌雙歧桿菌與乳酸菌在宿主消化、免疫調(diào)節(jié)以及慢性疾病的預(yù)防與治療方面發(fā)揮著重要作用。鑒于陰道環(huán)境與腸道環(huán)境在生理狀態(tài)和菌群組成上有很大的相似性,以及艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)與細(xì)菌性陰道炎(Bacterial vaginosis,BV)在發(fā)病機(jī)理與治療手段上的相似性。我們首次提出陰道菌群移植(Vaginal microbiota transplantation,VMT)的概念。該方法旨在利用正常人體的陰道菌群或?qū)⒎蛛x出的正常人體陰道益生菌混合物植入實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大鼠細(xì)菌性陰道炎模型,以期恢復(fù)與重構(gòu)失衡的陰道菌群,從根本上保護(hù)陰道微生態(tài)環(huán)境免受環(huán)境因素和致病菌的干擾。本課題的研究將為開發(fā)治療陰道炎癥的新型微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。方法:1.健康女性陰道分泌物中微生物的分離。從健康女性陰道分泌物中,通過菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)對(duì)陰道微生物進(jìn)行初步篩選,然后進(jìn)行測序確定篩選菌株種屬;2.分離菌株的體外益生性質(zhì)評(píng)價(jià)。通過體外實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)分離菌株的耐酸、耐膽鹽、抗氧化、抑制致病菌生長、細(xì)胞粘附、定植抗力等方面的特性;3.大鼠陰道炎模型的建立。實(shí)驗(yàn)分組為陰性對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、甲硝唑治療(MA組)、益生菌組合治療組(MP組)、陰道菌群移植治療組(MV組),每組5只。將乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌按照1:1:2的比例配制混懸液,對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠造模。造模期間解剖部分大鼠取子宮組織做HE染色,判斷造模是否成功。隨后連續(xù)治療7天,恢復(fù)一周進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);4.菌群移植對(duì)大鼠陰道炎模型的治療評(píng)價(jià)�；謴�(fù)期后,解剖,觀察各組大鼠子宮整體形態(tài)并做HE以觀察子宮病理變化,IHC染色觀察Caspase-3、Caspase-8、FasL表達(dá);q-PCR檢測子宮組織中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子轉(zhuǎn)錄水平;Elisa法檢測子宮組織中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子蛋白水平。高通量測序以及q-PCR判斷大鼠陰道群菌種類及數(shù)量的變化。結(jié)果:(1)從健康女性陰道分泌物中篩選出瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、唾液乳桿菌(L.salivarius),假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)以及表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。我們選出瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、唾液乳桿菌五株益生菌用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)菌株的益生性質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌及唾液乳桿菌對(duì)酸耐受程度與陰道酸性環(huán)境相一致,但多數(shù)菌不耐受膽鹽壓力;對(duì)常見的氧化自由基、超氧自由基、亞鐵離子、羥基自由基、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)等具有較好的清除能力,并且具有較好的總還原能力;分離菌株對(duì)細(xì)菌性陰道炎病原菌白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌等有較好的抑制生長作用;細(xì)胞粘附能力結(jié)果顯示,我們篩選的部分分離菌株對(duì)宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)細(xì)胞具有較好的粘附能力,并且對(duì)致病菌的定植具有良好的抵抗效果。(3)模型治療評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,C組的子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色以及子宮壁均表現(xiàn)為正常;M組的子宮炎癥明顯并且子宮壁變薄,正常結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)水腫充血現(xiàn)象;MA組經(jīng)過治療后,子宮炎癥消失但是個(gè)別樣本出現(xiàn)變形萎縮情況;MP組以及MV組的子宮形態(tài)正常,子宮壁形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。病理生理學(xué)HE檢測結(jié)果與子宮整體形態(tài)一致。IHC檢測結(jié)果顯示恢復(fù)期后Caspase-3、Caspase-8、FasL表達(dá)下調(diào)。M組與C組比較,其子宮組織IL-4的mRNA及蛋白水平明顯降低,而IL-1β、TNF-α的mRNA及蛋白水平則顯著升高。結(jié)果顯示,MP組及MV組陰道細(xì)菌感染均有顯著的改善(p0.05)。高通量測序與q-PCR結(jié)果顯示,MP組以及MV組與M組相比菌群豐度提高,腸球菌及腸桿菌數(shù)量減少,乳酸菌數(shù)量明顯增加;MA與MV組和MP組相比陰道菌群豐度明顯降低(p0.05)。結(jié)論:(1)陰道菌群移植和陰道益生菌組合對(duì)細(xì)菌性陰道感染疾病具有明顯的治療效果;(2)陰道菌群移植和陰道益生菌組合通過降低凋亡因子Caspase-3、Caspase-8、FasL的表達(dá),促進(jìn)抑炎因子IL-4的表達(dá)以及降低促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用;(3)高通量結(jié)果表明,盡管甲硝唑?qū)?xì)菌性陰道炎的治療具有良好的治療作用,但其在降低陰道炎癥的同時(shí)也降低了陰道菌群的多樣性。陰道菌群移植和陰道益生菌組合不僅對(duì)抑制陰道炎癥具有良好效果,而且能夠保持或恢復(fù)治療組大鼠陰道菌群的多樣性,從而對(duì)預(yù)防細(xì)菌性陰道炎的復(fù)發(fā)具有重要作用;(4)首次提出陰道炎治療的陰道菌群移植法,避免了使用抗生素帶來的危害,為開發(fā)治療陰道炎的新方法與藥物提供了線索與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R711.31
【部分圖文】：

VMT示意

圖 4.1 益生菌不同生長性質(zhì)評(píng)價(jià)。圖 4.1A 耐酸實(shí)驗(yàn)；圖 4.1B 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)4.2.2 陰道益生微生物抗氧化性評(píng)價(jià)氧自由基可以引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及遺傳物質(zhì) DNA 的損傷而引起氧

圖 4.2 益生菌抗氧化性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。4.2A 超氧自由基清除能力；4.2 B 二價(jià)鐵離子螯合能力；4.2 C 羥基自由基清除能力；4.2 D DPPH 自由基清除能力；4.2 E 總還原能力4.2.3 陰道益生微生物的抑菌作用抑制致病菌生長是益生菌的重要特性，益生菌可以通過產(chǎn)生過氧化氫
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本文編號(hào)：2857811