背景和研究目的:陰道微生態(tài)環(huán)境的菌群種類改變或數(shù)量失衡可引起多種陰道疾病。目前臨床上針對細菌性陰道感染疾病的治療手段主要是采用抗生素治療,而抗生素治療可顯著改變陰道的微生態(tài)環(huán)境并造成菌群失調(diào),從而導(dǎo)致治療效果不佳、復(fù)發(fā)率高等問題。大量研究表明,人體的健康狀態(tài)與腸道菌群密切相關(guān),且腸道益生菌雙歧桿菌與乳酸菌在宿主消化、免疫調(diào)節(jié)以及慢性疾病的預(yù)防與治療方面發(fā)揮著重要作用。鑒于陰道環(huán)境與腸道環(huán)境在生理狀態(tài)和菌群組成上有很大的相似性,以及艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)與細菌性陰道炎(Bacterial vaginosis,BV)在發(fā)病機理與治療手段上的相似性。我們首次提出陰道菌群移植(Vaginal microbiota transplantation,VMT)的概念。該方法旨在利用正常人體的陰道菌群或?qū)⒎蛛x出的正常人體陰道益生菌混合物植入實驗室構(gòu)建的大鼠細菌性陰道炎模型,以期恢復(fù)與重構(gòu)失衡的陰道菌群,從根本上保護陰道微生態(tài)環(huán)境免受環(huán)境因素和致病菌的干擾。本課題的研究將為開發(fā)治療陰道炎癥的新型微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。方法:1.健康女性陰道分泌物中微生物的分離。從健康女性陰道分泌物中,通過菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)對陰道微生物進行初步篩選,然后進行測序確定篩選菌株種屬;2.分離菌株的體外益生性質(zhì)評價。通過體外實驗,評價分離菌株的耐酸、耐膽鹽、抗氧化、抑制致病菌生長、細胞粘附、定植抗力等方面的特性;3.大鼠陰道炎模型的建立。實驗分組為陰性對照組(C組)、模型組(M組)、甲硝唑治療(MA組)、益生菌組合治療組(MP組)、陰道菌群移植治療組(MV組),每組5只。將乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌按照1:1:2的比例配制混懸液,對實驗大鼠造模。造模期間解剖部分大鼠取子宮組織做HE染色,判斷造模是否成功。隨后連續(xù)治療7天,恢復(fù)一周進行后續(xù)實驗;4.菌群移植對大鼠陰道炎模型的治療評價。恢復(fù)期后,解剖,觀察各組大鼠子宮整體形態(tài)并做HE以觀察子宮病理變化,IHC染色觀察Caspase-3、Caspase-8、FasL表達;q-PCR檢測子宮組織中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子轉(zhuǎn)錄水平;Elisa法檢測子宮組織中IL-4、IL-1β及TNF-α炎性因子蛋白水平。高通量測序以及q-PCR判斷大鼠陰道群菌種類及數(shù)量的變化。結(jié)果:(1)從健康女性陰道分泌物中篩選出瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、卷曲乳桿菌(L.crispatus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)、唾液乳桿菌(L.salivarius),假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)以及表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。我們選出瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、唾液乳桿菌五株益生菌用于后續(xù)實驗。(2)菌株的益生性質(zhì)評價結(jié)果顯示瑞士乳桿菌、卷曲乳桿菌、嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌及唾液乳桿菌對酸耐受程度與陰道酸性環(huán)境相一致,但多數(shù)菌不耐受膽鹽壓力;對常見的氧化自由基、超氧自由基、亞鐵離子、羥基自由基、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)等具有較好的清除能力,并且具有較好的總還原能力;分離菌株對細菌性陰道炎病原菌白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型溶血性鏈球菌等有較好的抑制生長作用;細胞粘附能力結(jié)果顯示,我們篩選的部分分離菌株對宮頸癌上皮細胞(Hela)細胞具有較好的粘附能力,并且對致病菌的定植具有良好的抵抗效果。(3)模型治療評價結(jié)果顯示,C組的子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色以及子宮壁均表現(xiàn)為正常;M組的子宮炎癥明顯并且子宮壁變薄,正常結(jié)構(gòu)被破壞,出現(xiàn)水腫充血現(xiàn)象;MA組經(jīng)過治療后,子宮炎癥消失但是個別樣本出現(xiàn)變形萎縮情況;MP組以及MV組的子宮形態(tài)正常,子宮壁形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。病理生理學(xué)HE檢測結(jié)果與子宮整體形態(tài)一致。IHC檢測結(jié)果顯示恢復(fù)期后Caspase-3、Caspase-8、FasL表達下調(diào)。M組與C組比較,其子宮組織IL-4的mRNA及蛋白水平明顯降低,而IL-1β、TNF-α的mRNA及蛋白水平則顯著升高。結(jié)果顯示,MP組及MV組陰道細菌感染均有顯著的改善(p0.05)。高通量測序與q-PCR結(jié)果顯示,MP組以及MV組與M組相比菌群豐度提高,腸球菌及腸桿菌數(shù)量減少,乳酸菌數(shù)量明顯增加;MA與MV組和MP組相比陰道菌群豐度明顯降低(p0.05)。結(jié)論:(1)陰道菌群移植和陰道益生菌組合對細菌性陰道感染疾病具有明顯的治療效果;(2)陰道菌群移植和陰道益生菌組合通過降低凋亡因子Caspase-3、Caspase-8、FasL的表達,促進抑炎因子IL-4的表達以及降低促炎因子IL-1β、TNF-α的表達而發(fā)揮抗炎作用;(3)高通量結(jié)果表明,盡管甲硝唑?qū)毦躁幍姥椎闹委熅哂辛己玫闹委熥饔?但其在降低陰道炎癥的同時也降低了陰道菌群的多樣性。陰道菌群移植和陰道益生菌組合不僅對抑制陰道炎癥具有良好效果,而且能夠保持或恢復(fù)治療組大鼠陰道菌群的多樣性,從而對預(yù)防細菌性陰道炎的復(fù)發(fā)具有重要作用;(4)首次提出陰道炎治療的陰道菌群移植法,避免了使用抗生素帶來的危害,為開發(fā)治療陰道炎的新方法與藥物提供了線索與實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R711.31
【部分圖文】：

VMT示意

圖 4.1 益生菌不同生長性質(zhì)評價。圖 4.1A 耐酸實驗；圖 4.1B 耐膽鹽實驗4.2.2 陰道益生微生物抗氧化性評價氧自由基可以引起細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及遺傳物質(zhì) DNA 的損傷而引起氧

圖 4.2 益生菌抗氧化性實驗評價。4.2A 超氧自由基清除能力；4.2 B 二價鐵離子螯合能力；4.2 C 羥基自由基清除能力；4.2 D DPPH 自由基清除能力；4.2 E 總還原能力4.2.3 陰道益生微生物的抑菌作用抑制致病菌生長是益生菌的重要特性，益生菌可以通過產(chǎn)生過氧化氫
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本文編號：2857811