第一部分MARCH1在卵巢惡性腫瘤中表達(dá)情況目的:明確MARCH1在卵巢惡性腫瘤中的作用,探索其在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況及其與卵巢惡性腫瘤臨床病理特征的關(guān)系。方法:通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)卵巢惡性腫瘤組織芯片和正常卵巢組織染色,觀察并記錄MARCH1在組織中的表達(dá)情況。分別按照染色強(qiáng)度不同分為0、1、2和3分,按照著色面積大小分為0、1、2和3分,組織染色評(píng)分為染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)乘著色面積分?jǐn)?shù)結(jié)果從0-9分,0分為陰性,0IHC≤4為弱陽(yáng)性;5≤IHC≤9為強(qiáng)陽(yáng)性。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析其中上皮性卵巢癌(EOC)組織中MARCH1染色結(jié)果與EOC臨床病理資料的相關(guān)性。結(jié)果:MARCH1在63例原發(fā)性卵巢惡性腫瘤組織中,34例(54.97%)卵巢惡性腫瘤組織強(qiáng)陽(yáng)性;而在4例正常卵巢組織和10例癌旁正常卵巢組織中,僅有2例(14.29%)強(qiáng)陽(yáng)性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MARCH1在卵巢癌組織中過(guò)表達(dá)。由于EOC樣本量不足,其MARCH1免疫組化結(jié)果與卵巢癌類型、分級(jí)或分期暫未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。結(jié)論:MARCH1在卵巢惡性腫瘤中起促癌作用。第二部分MARCH1促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為目的:探索MARCH1對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。方法:通過(guò)siRNA干擾技術(shù)敲減卵巢癌SKOV3細(xì)胞MARCH1,構(gòu)建敲減MARCH1(siMARCH1)組細(xì)胞和陰性對(duì)照(NC)組細(xì)胞。采用CCK-8試驗(yàn)和EdU染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。分別采用劃痕試驗(yàn)和基質(zhì)膠被覆Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力。結(jié)果:siRNA敲減MARCH1結(jié)果顯示細(xì)胞MARCH1在基因水平及蛋白水平均明顯降低。CCK-8結(jié)果顯示,在第1、2天,NC組和siMARCH1組細(xì)胞吸光值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,第3、4、5、6天,siMARCH1組細(xì)胞吸光值低于NC組細(xì)胞。EdU試驗(yàn)結(jié)果顯示,MARCH1敲減后,EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較NC組細(xì)胞少。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:試驗(yàn)第72小時(shí),MARCH1敲減組細(xì)胞劃痕寬度大于對(duì)照組細(xì)胞。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)48小時(shí)后,si MARCH1組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)較NC組少。結(jié)論:敲減MARCH1后,卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低。MARCH1促進(jìn)卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為。第三部分MARCH1調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制目的:探索MARCH1調(diào)控卵巢癌的分子機(jī)制。方法:采用熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè)細(xì)胞通路活性。采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)細(xì)胞中目的基因水平相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。采用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞中的分布和相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:MARCH1敲減后,卵巢癌細(xì)胞中NF-κB通路活性降低,RelA和p50蛋白不僅表達(dá)降低,同時(shí)其核內(nèi)分布減少。反之,通過(guò)PDTC抑制NF-κB通路后,MARCH1表達(dá)量降低。siRNA干擾敲減p50或RelA,MARCH1表達(dá)量降低。MARCH1敲減后,卵巢癌細(xì)胞中Wnt通路活性降低,其通路關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白表達(dá)量降低,入核減少;同時(shí),E-鈣粘蛋白表達(dá)升高。結(jié)論:抑制卵巢癌細(xì)胞中NF-κB通路可降低MARCH1表達(dá),敲減MARCH1后細(xì)胞中NF-κB通路受抑制,因此NF-κB和MARCH1形成相互調(diào)控的正反饋回路。另外,敲減MARCH1下調(diào)Wnt/β-catenin通路。第四部分卵巢癌SKOV3細(xì)胞中MARCH1潛在調(diào)控蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的:擬通過(guò)高通量篩選siMARCH1組對(duì)比NC組卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)變化蛋白,為進(jìn)一步研究MARCH1對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法:通過(guò)同位素標(biāo)記MARCH1敲減組和對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞的蛋白,結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析兩組細(xì)胞蛋白,篩選siMARCH1組比NC組蛋白的比值小于0.77或大于1.3的蛋白。通過(guò)蛋白組學(xué)庫(kù)分析篩選蛋白的功能學(xué)分類。通過(guò)mRNA驗(yàn)證篩選蛋白mRNA表達(dá)水平;采用western blot檢測(cè)篩選蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:通過(guò)iTRAQ結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果篩選到卵巢癌細(xì)胞MARCH1敲減后上調(diào)蛋白67個(gè),下調(diào)蛋白48個(gè)。篩選出的蛋白在mRNA水平驗(yàn)證結(jié)果和蛋白水平驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ結(jié)果變化水平一致。結(jié)論:篩選得到MARCH1敲減后卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生變化的蛋白,為進(jìn)一步研究MARCH1在卵巢癌細(xì)胞中作用的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

19圖 1-1 MARCH1 蛋白在正常卵巢組織及不同卵巢癌組織中免疫組化染色結(jié)果。（A）正常卵巢組織（B）漿液性腺癌（C）乳頭狀漿液性癌（D）液性腺癌（E）子宮內(nèi)膜樣癌（F）透明細(xì)胞癌（G）內(nèi)胚竇癌（H）顆粒細(xì)胞癌（I）無(wú)性細(xì)胞瘤（J）卵泡膜細(xì)胞瘤（K）轉(zhuǎn)移性腺癌（L）惡性成熟畸胎瘤。MARCH1 主要表達(dá)于卵巢癌組織中實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞漿及胞膜上。正常卵巢中難以檢測(cè)到 MARCH1 蛋白表達(dá)。Figure 1-1 Expression of MARCH1 in normal/benign ovary, and ovarian cancer tissue samplesby immunohistochemical staining. (A) Normal ovary. (B) Serous adenocarcinoma. (C)Papillary serous adenocarcinoma. (D) Mucinous adenocarcinoma. (E) Endometrioidcarcinoma. (F) Clear-cell carcinoma. (G) Endodermal sinus carcinoma. (H) Granular cellcarcinoma. (I) Dysgerminoma. (J) Theca cell tumors. (K) Metastatic adenocarcinoma. (L)Cancerous mature ovarian teratoma. MARCH1 staining was predominantly located in thecytoplasm and the cytomembrane of ovarian cancer tissues. MARCH1 expression wasundetectable in normal ovarian tissues.

35圖 2-1 MARCH1 在不同卵巢癌細(xì)胞株中表達(dá)情況re 2-1 Expression of MARCH1 in different ovarian cancer cel小 RNA 干擾（siRNA）技術(shù)敲減 MARCH1，并與含有C）組比較，觀察卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞中 MARCH1 表顯示：在預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 敲減序列中，三個(gè)序列均NA 水平的表達(dá)。其中，siMARCH1-2 序列在 MARC，平均敲減水平可達(dá) 97.25±2.76%（圖 2-2）。

SKOV3 細(xì)胞中 MARCH1 效率。siMARCH1-2 敲減序率最高。*表示與 NC（陰性對(duì)照）組比較，p<0.05。ct of siRNAs on silencing MARCH1 in SKOV3 cell. siMost efficient inhibition. *p<0.05 vs. the NC (negative co證 siRNA 敲減技術(shù)對(duì) SKOV3 細(xì)胞中 MARCH1n blot檢測(cè)NC組與siMARCH1組中MARCH1蛋RCH1-2 序列敲減后，細(xì)胞中 MARCH1 蛋白表上結(jié)果，siRNA 能有效地敲減 SKOV3 細(xì)胞中 M達(dá)，該技術(shù)可用于后續(xù)研究中建立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張彩,田志剛;腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2000年02期

本文編號(hào)：2854595