第一部分MARCH1在卵巢惡性腫瘤中表達情況目的:明確MARCH1在卵巢惡性腫瘤中的作用,探索其在卵巢惡性腫瘤組織中的表達情況及其與卵巢惡性腫瘤臨床病理特征的關系。方法:通過免疫組織化學染色方法對卵巢惡性腫瘤組織芯片和正常卵巢組織染色,觀察并記錄MARCH1在組織中的表達情況。分別按照染色強度不同分為0、1、2和3分,按照著色面積大小分為0、1、2和3分,組織染色評分為染色強度分數乘著色面積分數結果從0-9分,0分為陰性,0IHC≤4為弱陽性;5≤IHC≤9為強陽性。通過統(tǒng)計分析其中上皮性卵巢癌(EOC)組織中MARCH1染色結果與EOC臨床病理資料的相關性。結果:MARCH1在63例原發(fā)性卵巢惡性腫瘤組織中,34例(54.97%)卵巢惡性腫瘤組織強陽性;而在4例正常卵巢組織和10例癌旁正常卵巢組織中,僅有2例(14.29%)強陽性。統(tǒng)計結果發(fā)現MARCH1在卵巢癌組織中過表達。由于EOC樣本量不足,其MARCH1免疫組化結果與卵巢癌類型、分級或分期暫未發(fā)現統(tǒng)計學相關性。結論:MARCH1在卵巢惡性腫瘤中起促癌作用。第二部分MARCH1促進卵巢癌SKOV3細胞惡性生物學行為目的:探索MARCH1對卵巢癌細胞生物學行為的作用。方法:通過siRNA干擾技術敲減卵巢癌SKOV3細胞MARCH1,構建敲減MARCH1(siMARCH1)組細胞和陰性對照(NC)組細胞。采用CCK-8試驗和EdU染色檢測細胞的增殖能力。分別采用劃痕試驗和基質膠被覆Transwell試驗檢測細胞遷移能力和侵襲能力。結果:siRNA敲減MARCH1結果顯示細胞MARCH1在基因水平及蛋白水平均明顯降低。CCK-8結果顯示,在第1、2天,NC組和siMARCH1組細胞吸光值無統(tǒng)計學差別,第3、4、5、6天,siMARCH1組細胞吸光值低于NC組細胞。EdU試驗結果顯示,MARCH1敲減后,EdU陽性細胞數量較NC組細胞少。劃痕實驗結果顯示:試驗第72小時,MARCH1敲減組細胞劃痕寬度大于對照組細胞。侵襲實驗結果顯示:實驗48小時后,si MARCH1組穿過小室的細胞數較NC組少。結論:敲減MARCH1后,卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力降低。MARCH1促進卵巢癌增殖和轉移的惡性生物學行為。第三部分MARCH1調控卵巢癌SKOV3細胞生物學行為的分子機制目的:探索MARCH1調控卵巢癌的分子機制。方法:采用熒光素酶基因報告檢測細胞通路活性。采用實時熒光聚合酶鏈反應法檢測細胞中目的基因水平相對表達量。采用蛋白質印跡法檢測細胞中目的蛋白相對表達量。采用細胞免疫熒光法檢測目的蛋白在細胞中的分布和相對表達量。結果:MARCH1敲減后,卵巢癌細胞中NF-κB通路活性降低,RelA和p50蛋白不僅表達降低,同時其核內分布減少。反之,通過PDTC抑制NF-κB通路后,MARCH1表達量降低。siRNA干擾敲減p50或RelA,MARCH1表達量降低。MARCH1敲減后,卵巢癌細胞中Wnt通路活性降低,其通路關鍵蛋白β-連環(huán)蛋白表達量降低,入核減少;同時,E-鈣粘蛋白表達升高。結論:抑制卵巢癌細胞中NF-κB通路可降低MARCH1表達,敲減MARCH1后細胞中NF-κB通路受抑制,因此NF-κB和MARCH1形成相互調控的正反饋回路。另外,敲減MARCH1下調Wnt/β-catenin通路。第四部分卵巢癌SKOV3細胞中MARCH1潛在調控蛋白質組學研究目的:擬通過高通量篩選siMARCH1組對比NC組卵巢癌細胞中表達變化蛋白,為進一步研究MARCH1對卵巢癌細胞作用的分子機制提供基礎。方法:通過同位素標記MARCH1敲減組和對照組卵巢癌細胞的蛋白,結合串聯質譜分析兩組細胞蛋白,篩選siMARCH1組比NC組蛋白的比值小于0.77或大于1.3的蛋白。通過蛋白組學庫分析篩選蛋白的功能學分類。通過mRNA驗證篩選蛋白mRNA表達水平;采用western blot檢測篩選蛋白表達水平。結果:通過iTRAQ結合串聯質譜分析結果篩選到卵巢癌細胞MARCH1敲減后上調蛋白67個,下調蛋白48個。篩選出的蛋白在mRNA水平驗證結果和蛋白水平驗證結果與iTRAQ結果變化水平一致。結論:篩選得到MARCH1敲減后卵巢癌細胞中表達發(fā)生變化的蛋白,為進一步研究MARCH1在卵巢癌細胞中作用的分子機制提供基礎。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

19圖 1-1 MARCH1 蛋白在正常卵巢組織及不同卵巢癌組織中免疫組化染色結果。（A）正常卵巢組織（B）漿液性腺癌（C）乳頭狀漿液性癌（D）液性腺癌（E）子宮內膜樣癌（F）透明細胞癌（G）內胚竇癌（H）顆粒細胞癌（I）無性細胞瘤（J）卵泡膜細胞瘤（K）轉移性腺癌（L）惡性成熟畸胎瘤。MARCH1 主要表達于卵巢癌組織中實質細胞胞漿及胞膜上。正常卵巢中難以檢測到 MARCH1 蛋白表達。Figure 1-1 Expression of MARCH1 in normal/benign ovary, and ovarian cancer tissue samplesby immunohistochemical staining. (A) Normal ovary. (B) Serous adenocarcinoma. (C)Papillary serous adenocarcinoma. (D) Mucinous adenocarcinoma. (E) Endometrioidcarcinoma. (F) Clear-cell carcinoma. (G) Endodermal sinus carcinoma. (H) Granular cellcarcinoma. (I) Dysgerminoma. (J) Theca cell tumors. (K) Metastatic adenocarcinoma. (L)Cancerous mature ovarian teratoma. MARCH1 staining was predominantly located in thecytoplasm and the cytomembrane of ovarian cancer tissues. MARCH1 expression wasundetectable in normal ovarian tissues.

35圖 2-1 MARCH1 在不同卵巢癌細胞株中表達情況re 2-1 Expression of MARCH1 in different ovarian cancer cel小 RNA 干擾（siRNA）技術敲減 MARCH1，并與含有C）組比較，觀察卵巢癌 SKOV3 細胞中 MARCH1 表顯示：在預設計 siRNA 敲減序列中，三個序列均NA 水平的表達。其中，siMARCH1-2 序列在 MARC，平均敲減水平可達 97.25±2.76%（圖 2-2）。

SKOV3 細胞中 MARCH1 效率。siMARCH1-2 敲減序率最高。*表示與 NC（陰性對照）組比較，p<0.05。ct of siRNAs on silencing MARCH1 in SKOV3 cell. siMost efficient inhibition. *p<0.05 vs. the NC (negative co證 siRNA 敲減技術對 SKOV3 細胞中 MARCH1n blot檢測NC組與siMARCH1組中MARCH1蛋RCH1-2 序列敲減后，細胞中 MARCH1 蛋白表上結果，siRNA 能有效地敲減 SKOV3 細胞中 M達，該技術可用于后續(xù)研究中建立實驗組和對照
【參考文獻】

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1 張彩,田志剛;腫瘤免疫逃逸機制的研究進展[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);2000年02期

本文編號：2854595