研究背景宮頸癌(cervical cancer)是最常見的婦科惡性腫瘤之一,雖然隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展,該疾病發(fā)病率持續(xù)降低,但其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中仍位居第二位,全球每年約有46萬新發(fā)病例,僅次于乳腺癌;而死亡率為第四位,每年約有27萬死亡病例,絕大部分來自于發(fā)展中國家。研究表明,超過99%的宮頸癌是因人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)引起的。HPV主要通過性接觸或者皮膚接觸傳播,隨著性觀念開放和環(huán)境污染,子宮癌發(fā)病率正呈現(xiàn)出年輕化趨勢。目前已發(fā)現(xiàn)100多種不同類型的HPV,有14種類型屬于導(dǎo)致宮頸癌的“高風險”型HPV,其中70%的宮頸癌病例是由HPV-16型和HPV-18型引起的。雖然,預(yù)防性HPV疫苗最近已經(jīng)問世,而且HPV疫苗臨床使用安全性好,世界衛(wèi)生組織也鼓勵合適人群通過接種HPV疫苗來降低宮頸癌的發(fā)病率。然而,與宮頸癌發(fā)生的高危HPV亞型有14種,但目前已有疫苗只能針對其中的幾種,比如最常用的HPV 2價疫苗是針對高危的HPV-16 型和 HPV-18 型,HPV 9 價疫苗可防治 16、18、31、33、45、52 和 58型七種高危型HPV病毒和6、11兩種低危型HPV病毒。此外,宮頸癌疫苗面世時間尚短,實際保護效果還是通過長時間觀察才能確認�；谏鲜鲈�,宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的機制研究仍需要繼續(xù),并為新型診斷標志物和治療靶點篩選提供理論基礎(chǔ)。HPV感染導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病機制仍不明確,因此宮頸癌的篩查和診斷還需依賴液基細胞學(xué)、HPV DNA檢測,陰道鏡檢查,宮頸碘試驗以及宮頸組織病理檢查等方法。但由于檢查費用以及操作技術(shù)要求,導(dǎo)致上述檢測方法無法在發(fā)展中國家普及,目前也缺乏特異性強且易于操作的標志物用于宮頸癌臨床篩查。此外,手術(shù)和放化療聯(lián)合仍是宮頸癌治療的首選,然而宮頸癌病人預(yù)后差,治療后5年生存率不足40%,甚至晚期病人復(fù)發(fā)率超過30%。因此,科研人員致力于尋找可在分子水平早期診斷和治療宮頸癌的新手段。越來越多研究發(fā)現(xiàn)HPV通過調(diào)控宿主細胞的微小RNA(microRNA,miRNA)促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。miRNA是一類有內(nèi)源基因編碼的長度約20-25nt的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)域(3' ultranlated region,3'UTR)互補結(jié)合來抑制靶基因的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細胞功能。miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著十分重要的功能,既可以作為癌基因,降低抑癌基因表達;也可作為抑癌基因,抑制原癌基因活性或上調(diào)抑癌基因的活性。在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的每個階段,包括癌前病變到后期轉(zhuǎn)移,都有相應(yīng)的miRNA參與其中。例如,HPV感染宿主細胞后通過抑制miR-3156-3p表達來促進宮頸癌細胞生長和遷移。相反,高危的HPV-E7病毒通過TGF-β/Smad4分子通路增強miR-182表達,從而促進宮頸癌的發(fā)生。此外,miR-944高表達可作為宮頸癌預(yù)后差的標志。因此,miRNA有望成為宮頸癌新型診斷標志物和潛在治療靶點。多項研究表明,miR-494是一個抑癌基因。在口腔癌中,miR-494通過降低同源盒蛋白A 10(Homeobox protein A10,HOXA10)表達來抑制口腔癌細胞的生長。而在乳腺癌中,miR-494通過減少趨化因子受體CXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor 4)表達來降低Wnt/β-catenin分子通路活性,最終抑制乳腺癌的發(fā)生。此外,華蟾素(cinobufacin)通過調(diào)控miR-494來抑制胃癌細胞增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-494通過調(diào)低c-Myc和成纖維細胞生長因子受體2(Fibroblast Growth Factor Receptor 2,FGFR2)表達來抑制卵巢癌細胞生長。然而,miR-494在宮頸癌中的作用卻鮮有研究,僅有個別研究認為miR-494通過減少垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor-transforming 1,PTTG1)表達來抑制宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移。不過該文章已被退稿,實驗結(jié)果有待驗證。作為miR-494潛在靶基因的細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子6(suppressor of cytokine signaling,SOCS6)同樣也是一個抑癌基因。SOCS 的全稱是 Suppressor of cytokine signaling細胞因子信號抑制物,細胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合可導(dǎo)致信號傳導(dǎo)通路的活化,而將細胞因子的信號由胞膜傳到胞漿并最終傳至胞核,并引起目的基因的表達。目前研究發(fā)現(xiàn),SOCS至少有8種成員,SOCS1-7和CIS。表達的異常可以導(dǎo)致小鼠免疫功能異常。前期研究表明SOCS6是miR-494的靶基因。先前有研究表明SOCS6有抑制腫瘤生長、侵襲和遷移等作用,在大腸癌中,miR-301a通過降低SOCS6表達來促進大腸癌細胞生長和侵襲。miR-424-5p通過抑制SOCS6表達促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。miR-21和miR-155通過抑制SOCS6表達來促進肺癌發(fā)生和發(fā)展。而且SOCS6表達缺失預(yù)示著肺癌預(yù)后的低生存率。此外還有文章報道SOCS系統(tǒng)也可發(fā)揮促進癌癥發(fā)展的作用,SOCS1蛋白的過表達與三陰性乳腺癌臨分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,遠處轉(zhuǎn)移和組織學(xué)惡性程度明顯相關(guān)。與miR-494情況類似,SOSC6在宮頸癌中的作用還未有報道。目的(1)明確miR-494在健康人和宮頸癌病人血清以及miR494和SOSC6在癌組織和癌旁組織中的表達;(2)確認宮頸癌病人血清中miR-494的表達水平與其臨床病理學(xué)特征和5年存活率之間的關(guān)系;(3)探索miR-494和SOSC6靶向調(diào)控關(guān)系;(4)在體外細胞水平上明確miR-494和SOSC6對宮頸癌細胞生長和遷移的影響;(5)在體內(nèi)動物水平上確認miR-494和SOSC6對宮頸癌形成的影響。方法(1)利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法,檢測健康人和宮頸癌病人血清中、宮頸癌病人術(shù)前與術(shù)后一周血清中以及宮頸癌病人腫瘤組織與癌旁組織中miR-494的表達水平;(2)通過相關(guān)性分析評估宮頸癌病人血清中miR-494的表達水平與其臨床病理學(xué)特征和預(yù)后之間的關(guān)系;(3)利用qRT-PCR和蛋白免疫印跡(Western Blotting,WB)方法,檢測宮頸癌病人腫瘤組織與癌旁組織中SOSC6的表達水平;(4)利用qRT-PCR和WB方法,檢測多種宮頸癌細胞系中miR-494和SOSC6的表達水平;(5)合成 miR-494 mimics 和 inhibitors 以及 SOSC6 的干擾小 RNA(siRNA),轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞系Hela后利用qRT-PCR檢測miR-494和SOSC6的表達水平;(6)利用shRNA載體構(gòu)建SOSC6表達載體,通過測序進行鑒定后轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞系Hela,然后采用qRT-PCR檢測SOSC6的表達水平;(7)利用psiCHECKTM-2載體構(gòu)建含SOSC6野生型3'UTR和突變型3'UTR的熒光素酶報告基因載體,并通過測序進行鑒定;(8)利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)明確miR-494對SOSC6的靶向調(diào)控作用;(9)利用MTS和平板克隆形成實驗,檢測miR-494和SOSC6對宮頸癌細胞生長的影響;(10)利用流式細胞技術(shù),檢測miR-494和SOSC6對宮頸癌細胞凋亡和周期的影響;(11)利用Transwell小室技術(shù),檢測miR-494和SOSC6對宮頸癌細胞遷移和侵襲的影響;(12)利用裸鼠成瘤實驗,檢測miR-494和SOSC6對宮頸癌形成的影響。結(jié)果(1)相比于健康人,宮頸癌病人血清中的miR-494表達水平顯著降低;90%宮頸癌病人術(shù)后一周血清中的miR-494表達水平與術(shù)前相比有所升高;此外,宮頸癌病人腫瘤組織的miR-494表達明顯低于癌旁組織中的表達;(2)血清中的miR-494與腫瘤大小、腫瘤分化和預(yù)后關(guān)系密切;(3)相比于宮頸癌病人的癌旁組織,宮頸癌病人腫瘤組織中的SOSC6表達水平顯著降低;(4)相比于人正常宮頸內(nèi)膜上皮細胞End1/E6E7,人宮頸癌細胞系中的miR-494表達水平明顯降低,同時SOSC6的表達水平(包括mRNA和蛋白)也顯著降低;(5)miR-494 mimics 和 inhibitors 以及 SOSC6 的干擾小 RNA(Small interfering RNA,siRNA)在宮頸癌細胞系Hela細胞中成功調(diào)控miR-494和SOSC6的表達;(6)把 SOSC6 的開放閱讀框(open reading frame,ORF)克隆到 shRNA 載體并通過測序鑒定后成功構(gòu)建SOSC6表達載體,而且可以在宮頸癌細胞系Hela細胞中表達SOSC6;(7)把SOSC6野生型3'UTR和突變型3'UTR克隆到psiCHEClKTM-2載體并通過測序鑒定后成功構(gòu)建 psiCHECKTM-2-SOSC6野生型 3'UTR和psiCHECKTM-2-SOSC6突變型3'UTR熒光素酶報告基因載體;(8)熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示miR-494對SOSC6有靶向調(diào)控作用;(9)MTS和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,miR-494和SOSC6均抑制宮頸癌細胞生長;(10)流式細胞實驗結(jié)果顯示,miR-494過表達抑制宮頸癌細胞從G1期進入S期,以及顯著誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡;miR-494沉默加快宮頸癌細胞從G1期進入S期,以及抑制宮頸癌細胞凋亡;SOSC6過表達抑制宮頸癌細胞從G1期進入S期,以及顯著誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡;SOSC6沉默加快宮頸癌細胞從G1期進入S期,以及抑制宮頸癌細胞凋亡;(11)Transwell小室實驗結(jié)果顯示,miR-494過表達抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲,而miR-494沉默則促進宮頸癌細胞遷移和侵襲;SOSC6過表達抑制宮頸癌細胞遷移和侵襲;(12)裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示,miR-494過表達抑制宮頸癌腫瘤形成,而miR-494沉默則抑制宮頸癌腫瘤形成;SOSC6過表達抑制宮頸癌腫瘤形成,相反,SOSC6沉默則促進宮頸癌腫瘤形成。結(jié)論(1)miR-494在宮頸癌病人血清以及癌組織中低表達,且在90%手術(shù)后的宮頸癌病人血清中高表達,SOSC6在宮頸癌組織中低表達;(2)miR-494與宮頸癌腫瘤大小,腫瘤分化和預(yù)后密切相關(guān);(3)首次在宮頸癌中確定了 miR-494和SOSC6的互作以及miR-494對SOSC6的靶向調(diào)控作用;(4)細胞實驗和動物實驗都證實miR-494對SOSC6的靶向調(diào)控作用,已經(jīng)明確miR-494和SOSC6通過對宮頸癌細胞生長、凋亡、細胞周期、遷移和侵襲的調(diào)控來影響宮頸癌發(fā)生和發(fā)展;(5)miR-494和SOSC6對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制闡述可為宮頸癌早期診斷提供分子指標,以及為后續(xù)的治療提供新的靶點。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

發(fā)展和轉(zhuǎn)移［２８－３２］。ｍｉＲＮＡ是一類有內(nèi)源基因編碼的長度約２０－２５ｎｔ的非編碼??ＲＮＡ，本身不翻譯蛋白，通過與靶基因ｍＲＮＡ的３＇非編碼區(qū)域互補結(jié)合來抑制??靶基因的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細胞功能（圖１）?［３３，３４］。ｍｉＲＮＡ在多種??癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著十分重要的功能，既可以作為癌基因，降低抑??癌基因表達，也可作為抑癌基因，抑制原癌基因活性［３４－３６］。??１６??

通過對健康人和宮頸癌病人的外周血清中的ｍｉＲ－４９４表達情況進行檢測，我??們發(fā)現(xiàn)，相比于健康人，宮頸癌病人血清中的ｍｉＲ－４９４表達水平顯著降低（尸＜０．０５）??（圖２），這預(yù)示著ｍｉＲ－４９４可能對于宮頸癌發(fā)生和發(fā)展有重要的作用。??ｍｉＲ－４９４?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??６－??ｃ?？▲癱畚??｜?？？？？？？？？??Ｓ?４－??Ｉ?，??〇??＾?２－?■■麵■??１?被??０Ｊ?１?１???／?／??圖２健康人和宮頸癌病人血清中ｍｉＲ－４９４表達的比較情況??１．２?ｍｉＲ－４９４在宮頸癌病人術(shù)前與術(shù)后一周血清中的表達情況??接著，我們對１４例宮頸癌患者（術(shù)前與術(shù)后一周均有凍存血漿的患者）的??外周血檢測ｍｉＲ－４９４的表達水平，發(fā)現(xiàn)９０％的宮頸癌病人術(shù)后一周血清中的??ｍｉＲ－４９４表達水平與術(shù)前相比有所升高，提示ｍｉＲ－４９４可能對宮頸癌預(yù)后有指示??作用（Ｐ＜〇＿〇５）（圖?３）。??４２??

１．３?ｍｉＲ－４９４在宮頸癌病人腫瘤組織與癌旁組織中的表達情況??為明確ｍｉＲ－４９４在宮頸癌組織中的表達情況，我們也在宮頸癌病人的腫瘤組??織和癌旁組織中檢測ｍｉＲ－４９４的表達水平，結(jié)果顯示宮頸癌病人腫瘤組織的??ｍｉＲ－４９４表達明顯低于其在癌旁組織中的表達（ＰＣ０．０５）（圖４）。??４３??
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本文編號：2852274