研究背景宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)十分常見的惡性腫瘤,其主要病因是高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染,HPV編碼的癌蛋白E6/E7是導致宮頸細胞惡性轉化的關鍵蛋白。放射治療是中晚期宮頸癌的重要治療方法,放療后復發(fā)仍然是宮頸癌患者治療中的主要問題,研究其分子機制是解決腫瘤細胞放射耐受的關鍵。有研究表明HPV陽性的細胞系SiHa、HeLa比HPV陰性細胞系C33A對放射更耐受,研究HPV在宮頸癌放療中的作用能為更好的治療宮頸癌提供新思路和靶標。小GTP酶蛋白Rab屬于Ras蛋白超家族的一員,很多癌癥中存在Rab的異常表達。Rab12與分布在胞質中的小囊泡相關聯(lián),它可能加速囊泡從細胞邊緣到核周中心體區(qū)域轉運,也可以通過控制循環(huán)內(nèi)體到溶酶體的載體運輸這一途徑,間接地刺激自噬。DENND3是Rab12的上游分子,RILP-L1、RILP是Rab12的效應分子。放射可誘導細胞發(fā)生自噬,自噬可能作為細胞保護機制,通過清除異常蛋白質和缺陷細胞器保持營養(yǎng)和能量的體內(nèi)平衡。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)HPV編碼的早期癌蛋白E6與E7可上調Rab12的表達,Rab12是否對HPV陽性宮頸癌細胞放射耐受起作用有待研究。研究目的研究Rab12對宮頸癌放射敏感性的影響及其機制。研究方法與結果1.HPV早期癌蛋白E6/E7影響Rab12的表達利用逆轉錄病毒包裝系統(tǒng)獲得含質粒pBabe-Vector、HPV16E6和HPV16E7的病毒顆粒,感染細胞并用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達E6/E7的細胞系,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)E6/E7可上調Rab12的表達。在宮頸癌SiHa、Caski細胞(HPV16陽性的宮頸癌細胞)中干擾16E6/E7,在HeLa細胞(HPV18陽性的宮頸癌細胞)中干擾18E6/E7,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)干擾E6/E7后Rab12的表達降低。2.射線對細胞中Rab12表達的影響Western blot 檢測不同細胞系 SiHa、HeLa、C33A、HaCaT 放射前后 Rab12的表達量。進一步檢測SiHa細胞放射后不同時間,以及不同放射劑量梯度下Rab12的表達。發(fā)現(xiàn)放射可促進Rabl2表達。3.Rab12與宮頸癌放療敏感性的研究SiHa細胞分為NC組與干擾Rab12組,C33A細胞(HPV陰性的宮頸癌細胞)分為NC組與過表達Rab12組,分別照射不同劑量梯度的的X射線,通過克隆形成實驗、繪制生存率曲線、CCK-8實驗檢測射線對不同處理組細胞生長增殖情況和活力的影響。在SiHa細胞干擾Rab12組,細胞增殖更慢,活力更低;在C33A細胞過表達Rab12組,細胞增殖更快,活力更高。這表明Rab12促進了宮頸癌細胞的放射抵抗。4.放射條件下宮頸癌細胞中Rab12與細胞凋亡的研究Western Blot檢測放射組與化療組處理后凋亡相關的蛋白PARP1、Cleaved-PARP1與Bcl-2的表達變化,結果顯示放射后24h,SiHa細胞凋亡沒有明顯變化。而順鉑處理后24h可看到Bcl-2隨藥物劑量的增加而明顯減少,PARP1也被剪切成Cleaved-PARP1。SiHa細胞在化療藥物順鉑誘導下的細胞凋亡可能是其主要死亡形式,而SiHa細胞對放療的反應中,細胞凋亡途徑起到的作用相對較小,Rab12影響宮頸癌放療敏感性并不是通過影響相關的細胞凋亡途徑。5.Rab12對宮頸癌細胞自噬的影響干擾Rab12與無血清饑餓誘導自噬,Western Blot檢測自噬相關指標p62、Beclin1、LC3B,結果表明人宮頸癌細胞中Rab12與細胞自噬有關。SiHa細胞分為NC組與干擾Rab12組,Western Blot檢測不同梯度劑量照射下以及照射后不同梯度時間下的自噬相關指標p62、Beclin1、LC3B,結果表明干擾Rab12可逆轉放射引起的自噬升高。6.Rab12對宮頸癌細胞放射后細胞周期的影響流式細胞術檢測放射、順鉑、博來霉素處理24h后SiHa細胞干擾Rab12組與NC組細胞周期變化,檢測放射后C33A細胞Rab12組與NC組。干擾Rab12和過表達Rab12不改變正常生長狀態(tài)下細胞的細胞周期,但是可以影響放射或藥物損傷后細胞周期的分布。結論本研究首次證實了 HPV早期癌蛋白E6、E7可上調Rab12的表達,過表達Rab12后的宮頸癌細胞生長增殖加快,提示Rab12可能與腫瘤的惡性程度相關。Rab12參與調節(jié)HPV陽性宮頸癌細胞的放射耐受,其作用主要是通過促進細胞保護性自噬,調控細胞周期來實現(xiàn)的。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：

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本文編號：2851068