本文關鍵詞：探討人卵巢組織玻璃化凍存及卵母細胞的獲取，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:玻璃化冷凍是一種快速、簡易、經(jīng)濟的凍存卵巢組織方法,對人類和動物卵巢組織凍存具有很大前景,由于卵巢組織不同于胚胎和卵母細胞,所以其凍存方法有很大改善空間。目前唯一可靠評價冷凍效果的是臨床妊娠率和出生率,改善玻璃化冷凍方法的最好方式為針對冷凍方案中單因素逐步改進,本研究在僅改變一個參數(shù)的基礎上,選擇出最適合卵巢組織玻璃化凍存的冷凍保護劑濃度,并在此基礎上獲取未成熟卵母細胞行成熟培養(yǎng),作為不宜行卵巢刺激及不可延誤進一步治療的女性保留生育力的最佳手段。材料與方法:收集40例2014年3月~9月因卵巢良性腫物行手術者,取其剝離的卵巢囊腫壁上殘留卵巢組織共40片,利用患者手術切除的廢棄組織進行研究。切割卵巢皮質前使用22號針頭+5ml注射器吸取可見卵泡,將吸取液注入卵母細胞洗滌液GMOPS中,余各組卵巢組織切割成大小1mm×1mm×5mm的卵巢皮質塊,各組隨機取其中8塊,按玻璃化冷凍液不同濃度隨機分為4組,玻璃化冷凍組3組,另一組為對照組(新鮮組)。獲取的未成熟卵母細胞置于含培養(yǎng)液的四孔皿中,放于37℃含5%CO2高濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后,分離成熟卵母細胞行玻璃化冷凍存于液氮中。新鮮對照組的卵巢皮質塊行10%中性福爾馬林固定待用。3組玻璃化冷凍組皮質塊以篩網(wǎng)為載體分別經(jīng)3種不同濃度冷凍液處理后放入液氮中保存一周后解凍,經(jīng)10%中性福爾馬林固定后行HE染色及免疫組化標記,分析比較3組玻璃化冷凍組與新鮮對照組凍融前后卵泡形態(tài)學變化、細胞增殖及凋亡程度,并判定計數(shù)成熟卵母細胞數(shù)量。結果:1.卵巢組織形態(tài)學評估及計數(shù)各級卵泡數(shù)量CPA1與對照組比較各級卵泡數(shù)量,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3組玻璃化冷凍組,無論哪種冷凍方法復蘇后對卵巢組織始基卵泡影響均不明顯,但可見卵巢組織內部分間質細胞排列紊亂、疏松甚至出現(xiàn)分離。2.免疫組化結果比較計數(shù)每10個高倍視野陽性細胞數(shù),玻璃化冷凍組與對照組比較,僅CPA1組卵巢組織中各級卵泡卵母細胞及顆粒細胞中Ki-67表達與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.Tunel細胞凋亡檢測結果玻璃化冷凍組與對照組始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡內均未見凋亡細胞,僅部分間質細胞核、血管內皮細胞核內可見凋亡顆粒。4.玻璃化凍存卵母細胞數(shù)量未成熟卵泡來自于12例病人卵巢皮質,成熟培養(yǎng)后其平均成熟率為82.7%,共20枚成熟卵母細胞經(jīng)玻璃化凍存。結論:1.采用DMSO與EG低濃度配伍組無論是光鏡下卵泡形態(tài),細胞增殖活性還是細胞凋亡程度均與對照組無統(tǒng)計學差異,明顯優(yōu)于高濃度組及PROH聯(lián)合EG組。2.對于不宜行卵巢刺激及不可延誤進一步治療的女性,玻璃化凍存卵巢組織塊及抽取不成熟卵母細胞行體外成熟培養(yǎng)可作為該類患者保留生育能力的最佳手段。3.篩網(wǎng)作為新型冷凍載體凍存卵巢組織,推動了卵巢組織玻璃化冷凍的新進展。
【關鍵詞】：卵巢組織 玻璃化冷凍 冷凍保護劑 IVM Ki-67 細胞凋亡
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11
• 研究目的、方法11-13
• 對象和方法13-19
• 1 實驗對象13-15
• 1.1 組織來源及處理13
• 1.2 主要試劑13-14
• 1.3 主要設備及耗材14-15
• 1.4 冷凍保護液的配備15
• 1.5 卵巢組織及卵母細胞冷凍復蘇液的配備15
• 2 實驗方法15-18
• 2.1 未成熟卵母細胞成熟培養(yǎng)及玻璃化凍存15-16
• 2.1.1 未成熟卵母細胞成熟培養(yǎng)15-16
• 2.1.2 成熟卵母細胞玻璃化凍存16
• 2.2 分組16
• 2.3 方法16
• 2.3.1 對照組16
• 2.3.2 玻璃化冷凍組16
• 2.3.3 復蘇方法16
• 2.4 人卵巢組織冷凍復蘇效果判斷16-18
• 2.4.1 卵巢組織結構分析16
• 2.4.2 卵母細胞成熟度判定16-17
• 2.4.3 細胞增殖活性檢測17-18
• 2.4.4 細胞凋亡檢測18
• 3 統(tǒng)計學處理18-19
• 結果19-24
• 1 對照組與玻璃化冷凍組HE染色結果比較19-20
• 2 對照組與玻璃化冷凍組免疫組化結果比較20-21
• 3 對照組與玻璃化冷凍組Tunel細胞凋亡檢測結果21-22
• 4 玻璃化凍存卵母細胞數(shù)量22-24
• 討論24-30
• 1 傳統(tǒng)程序化冷凍方法和玻璃化冷凍24
• 2 卵巢玻璃化冷凍的影響因素24-27
• 2.1 玻璃化冷凍液配伍及濃度25-26
• 2.2 CPA溫度26
• 2.3 逐步添加溶液26
• 2.4 卵巢組織塊大小26-27
• 2.5 玻璃化冷凍載體27
• 2.6 專業(yè)的技術27
• 3 凍融后效果檢測27-30
• 3.1 卵巢組織結構分析27-28
• 3.2 細胞增殖活性28
• 3.3 細胞凋亡28
• 3.4 未成熟卵母細胞成熟培養(yǎng)28-30
• 結論30-31
• 參考文獻31-35
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明35-36
• 綜述 女性腫瘤患者生育力的保存36-46
• 綜述參考文獻42-46
• 致謝46-47

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