第一部分 NIPT在胎兒染色體異常中的應(yīng)用研究研究目的:通過(guò)分析62780例孕婦NIPT產(chǎn)前篩查結(jié)果,進(jìn)行了無(wú)創(chuàng)胎兒染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常全基因組新型檢測(cè)技術(shù)的探索。探討利用孕婦血漿中cffDNA檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的新方法及評(píng)價(jià)其在臨床上的應(yīng)用價(jià)值。方法:選取自愿參與NIPT檢測(cè)的單胎孕婦60961例,雙胎孕婦1819例,經(jīng)高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析后,將NIPT篩查高風(fēng)險(xiǎn)的胎兒全部納入實(shí)驗(yàn)組,包括13、18、21號(hào)染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)、胎兒性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)、罕見(jiàn)染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)及存在基因組拷貝數(shù)異常的病例。經(jīng)知情同意后通過(guò)介入性產(chǎn)前診斷技術(shù),對(duì)NIPT產(chǎn)前篩查結(jié)果為胎兒染色體的數(shù)目異常及大片段結(jié)構(gòu)異常,以染色體核型為金標(biāo)準(zhǔn),NIPT產(chǎn)前篩查結(jié)果為基因組拷貝數(shù)變異,經(jīng)染色體微陣列芯片(CMA)驗(yàn)證結(jié)果為依據(jù)。結(jié)果:1.共檢測(cè)60961例單胎孕婦標(biāo)本,檢出13、18、21非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦482例,其中368例接受胎兒染色體核型分析,確診胎兒染色體異常311例,胎兒染色體正常57例;檢出性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦270例,其中138例接受胎兒染色體核型分析,確診胎兒染色體異常79例,胎兒染色體正常59例;檢出罕見(jiàn)染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦158例,其中94例接受胎兒染色體核型分析,確診胎兒染色體異常8例,胎兒染色體正常86例。NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦中有3例非整倍體假陰性:2例21三體、1例18三體。2.共篩查出T21高風(fēng)險(xiǎn)孕婦301例,251例進(jìn)行核型分析,其中確診236例(內(nèi)含6例嵌合型21三體,3例易位型21-三體),假陽(yáng)性15例,本研究中NIPT檢測(cè)胎兒T21 的敏感度為 99.16%(97.00-99.90%),特異度99.98%(99.96-99.99%),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值94.02%(90.46-96.31%),陰性預(yù)測(cè)值 100.00%(99.99-100.00%);T18高風(fēng)險(xiǎn)孕婦127例,82例進(jìn)行核型分析,其中確診61例(內(nèi)含2例嵌合型18三體),假陽(yáng)性21例,檢測(cè)T18的敏感度為98.41%(91.47-99.96%),特異度99.97%(99.95-99.98%),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 74.70%(65.79-81.93%),陰性預(yù)測(cè)值100.00%(99.99-100.00%);T13高風(fēng)險(xiǎn)孕婦54例,35例進(jìn)行核型分析,確診14例,假陽(yáng)性21例,檢測(cè)T13的敏感度為100%(76.84-100.00%),特異度99.97%(99.95-99.98%),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值40.00%(65.79-81.93%),陰性預(yù)測(cè)值 100.00%。3.共篩查出45,X高風(fēng)險(xiǎn)孕婦120例,58例進(jìn)行核型分析,其中確診18例,假陽(yáng)性40例,NIPT篩查45,X的敏感度為100%,特異度99.93%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值31.03%,陰性預(yù)測(cè)值100.00%。47,XXX高風(fēng)險(xiǎn)孕婦62例,35例進(jìn)行核型分析,其中確診22例,假陽(yáng)性13例,47,XXX敏感度為100.00%,特異度99.98%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值62.86%,陰性預(yù)測(cè)值100.00%。47,XXY高風(fēng)險(xiǎn)孕婦48例,28例進(jìn)行核型分析,確診24例,假陽(yáng)性4例,47,XXY敏感度為100.00%,特異度99.99%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值85.71%,陰性預(yù)測(cè)值100.00%。47,XYY高風(fēng)險(xiǎn)孕婦40例,17例進(jìn)行核型分析,確診15例,假陽(yáng)性2例,47,XYY敏感度為100.00%,特異度100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值85.24%,陰性預(yù)測(cè)值100.00%。4.檢出罕見(jiàn)染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦158例,95例進(jìn)行核型分析,其中87例胎兒染色體正常,另外8例確診為胎兒染色體異常,胎兒染色體非整倍體異常8 例為:47,XN,+2[7]/46,XN[43]、47,XN,+5[25]/46,XN[25]、47,XN,+15[4]/46,XN[46]、47,XN,+22[10]/46,XN[40]、47,XN,+16[2]/46,XN[74]、47,XN,+16[2]/46,XN[98]、47,XN,+9[10]/46,XN[40]、47,XN,+9[11]/46,XN[39]。5.染色體結(jié)構(gòu)異常及基因組拷貝數(shù)變異高風(fēng)險(xiǎn)133例,其中72例在我院接受胎兒染色體核型及CMA分析,確診胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常及基因組拷貝數(shù)變異34例,胎兒染色體結(jié)構(gòu)正常及基因組拷貝數(shù)正常38例。檢出染色體缺失及重復(fù)不平衡易位1例,16號(hào)染色體部分三體1例、兩例Emanuel綜合征等,漏診兩例胎兒,1例為22q13.3區(qū)域發(fā)生4.03Mb片段缺失的Phelan—McDermid綜合征(Phelan-McDermid syndrome,PMDS,OMIM 606232),另 1例為Xp22.33擬常染色體區(qū)均存在857kb雜合缺失。6.共檢測(cè)1819例雙胎孕婦標(biāo)本,檢出高風(fēng)險(xiǎn)孕婦13例。10例進(jìn)行核型分析,21三體高風(fēng)險(xiǎn)5例均為一胎21三體,另一胎核型正常,18三體高風(fēng)險(xiǎn)3例,確診2例,XXX高風(fēng)險(xiǎn)1例,確診一胎為47,XXX,另一胎核型正常。NIPT結(jié)果提示染色體13q14.3-q21.1存在6.19Mb缺失結(jié)構(gòu)異常高風(fēng)險(xiǎn)1例,3號(hào)染色體長(zhǎng)臂3.06Mb的母體CNV導(dǎo)致了 NIPT結(jié)果的假陽(yáng)性。結(jié)論:1.NTPT共檢測(cè)62780例孕婦標(biāo)本,其中單胎孕婦60961例,雙胎孕婦1819例。我們研究結(jié)果表明NIPT使98.3%(61724/62780)的孕婦避免了不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷操作,減少了受檢者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不必要的心理壓力。2.NIPT對(duì)于T13、T18、T21敏感性及特異性均高于98%,T21、T18、T13的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為94.02%、74.70%、40.00%,NIPT會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果的出現(xiàn),其陽(yáng)性結(jié)果仍需要有創(chuàng)產(chǎn)前診斷確證胎兒核型。3.NIPT技術(shù)雖然可以檢測(cè)出性染色體的異常,但對(duì)于45,X 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低。NIPT的篩查范圍可以擴(kuò)大至性染色體非整倍體,但出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能性增加,特別是Turner綜合征,必須行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷確診。4.60961例中僅僅檢測(cè)到8例罕見(jiàn)的嵌合型的常染色體三體患者,由于一些罕見(jiàn)的染色體嵌合的核型、程度、范圍各異,沒(méi)有固定的答案可循。NIPT—般不建議NIPT用于篩查13、18、21號(hào)染色體以外的罕見(jiàn)的常染色體非整倍體,NIPT擴(kuò)大到檢測(cè)罕見(jiàn)的非整倍體時(shí),應(yīng)向患者解釋假陽(yáng)性的可能,同時(shí)進(jìn)行B超檢測(cè)及有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷來(lái)進(jìn)一步診斷。5.NIPT檢測(cè)胎兒染色體大片段結(jié)構(gòu)異常及微缺失微重復(fù)具有可行性,cffDNA篩查可能有助于識(shí)別胎兒的缺失和重復(fù),在某些情況下可能表明父母是平衡易位攜帶者的風(fēng)險(xiǎn),從而為懷孕夫婦提供了明確的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢。對(duì)有異常臨床表型的孕婦,在行NIPT檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí),應(yīng)首先排除孕婦本人遺傳背景的影響。若證實(shí)其為母源因素造成的假陽(yáng)性,也不應(yīng)輕易放棄對(duì)其深入的分析,對(duì)這些遺傳因素的深入分析,有助于NIPT檢測(cè)在染色體微小結(jié)構(gòu)異常的結(jié)果分析。6.NIPT用于雙胎孕婦的篩查具有良好的檢測(cè)效率,21三體檢出率和特異性均為100%,雖然不能通過(guò)NIPT來(lái)判斷異常胎兒的個(gè)數(shù)和位置,但是可以避免98%以上的雙胎孕婦進(jìn)行羊水穿刺帶來(lái)的痛苦和流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。雙胎NIPT研究報(bào)道數(shù)量少,樣本量有限,雙胎NIPT檢測(cè)仍需要更多的研究進(jìn)行論證。7.NIPT檢測(cè)具有高敏感性和高特異性,但由于這項(xiàng)技術(shù)只能用于篩查而不是對(duì)胎兒核型的診斷,NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦仍需要通過(guò)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷確診。第二部分 GUCY2D基因突變功能研究研究目的:Leber先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis,LCA)是常染色體隱性遺傳病,可導(dǎo)致嬰兒在出生后不久完全喪失視力并伴有一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。通過(guò)二代測(cè)序及Sanger測(cè)序技術(shù),在先證者家系中檢測(cè)GUCY2D基因發(fā)現(xiàn)三個(gè)臨床意義未明突變 c.139_139delC(Ala49Profs*36)、c.2783GA(Gly928Glu)和 c.835GA(Asp279Asn)。經(jīng)查閱數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn),這三個(gè)突變屬于新發(fā)突變無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道。采用SIFT、Polyphen-2和Mutation Tasting三個(gè)工具軟件預(yù)測(cè)分析,其結(jié)果都是有害致病突變。對(duì)這三個(gè)突變的細(xì)胞生物學(xué)和功能研究將為L(zhǎng)CA致病機(jī)制的探索提供理論依據(jù)。方法和結(jié)果:采用UCSF Chimera軟件對(duì)野生型及突變型蛋白Gly928三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果提示Gly928突變?cè)斐纱呋δ芙档汀?gòu)建野生型及突變型Ala49Profs*36、Asp279Asn和Gly928Glu與綠色熒光蛋白EGFP融合表達(dá)載體,熒光共聚焦顯微鏡觀察Ala49Profs*36熒光信號(hào)弱,提示蛋白降解。Asp279Asn和Gly928Glu經(jīng)HPLC-MS/MS分析,發(fā)現(xiàn)其cGMP均降低,提示突變改變了酶活性。結(jié)論:通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察和HPLC-MS/MS分析,分別證實(shí)Ala49Profs*36、Asp279Asn和Gly928Glu為GCUCY2D基因致病突變。本研究是在二代高通量測(cè)序基礎(chǔ)上,對(duì)GUCY2D基因發(fā)現(xiàn)的三個(gè)新突變位點(diǎn)開(kāi)展的功能研究,不僅能明確患者致病基因、致病突變及其功能影響,還能豐富疾病表型譜和突變譜,為研究GUCY2D基因致病機(jī)制提供理論依據(jù),對(duì)遺傳咨詢、基因診斷、產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學(xué)診斷等臨床遺傳學(xué)服務(wù)具有重要應(yīng)用價(jià)值。研究證實(shí)二代測(cè)序技術(shù)在遺傳病的診斷中有極大的應(yīng)用價(jià)值,致病性突變功能研究為疾病致病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R714.5
【部分圖文】：

寬約０．３０ｃｍ．右側(cè)側(cè)腦室后腳寬約０．７６ｃｍ，左側(cè)側(cè)腦室后腳寬約０．９４ｃｍ．后顱窩池逡逑寬約丨．Ｏｃｍ，檢查顯示羊水增多，胎兒左心室點(diǎn)狀高回聲。孕３３周通過(guò)臍血穿剌術(shù)逡逑進(jìn)行臍血染色體核型分析，結(jié)果顯示胎兒染色體核型為４７．ＸＹ＋１８邋（圖１），外周血逡逑ＮＩＰＴ分析結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，孕３５＋周終止妊娠，獲得胎盤(pán)組織進(jìn)行ＦＩＳＨ檢測(cè)。臍帶根逡逑部、羊膜、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間質(zhì)，胎盤(pán)母面中心其Ｔ１８嵌合分別為８０°／。、５０％逡逑和１０％、２０％、１５°／。（圖１），正常胎盤(pán)組織相似點(diǎn)取樣，結(jié)果顯示無(wú)Ｔ１８嵌合。逡逑ｋ邐ｋ邐＞）邐Ｉｔ邐Ｋ逡逑１邐２邐３邐４邐＆逡逑ｉｉ邋ｌ＜邋ｈ邋ｈ邋ｕ邋ｎ逡逑?邐７邐８邐９邐１０邐１１邐１２逡逑Ｍ邐１１邐１１邐ｉｉ邐ｕ邐＞ｉｉ逡逑１３邐Ｍ邐ｌｂ邐１Ｃ邐１７邐ＩＢ逡逑ＩＩ邐Ｍ邐０４邐？＃邐％邐Ｉ逡逑１０邐２０邐２１邐２２邐ｌ邐Ｖ逡逑圖１．１邐（Ａ）胎兒染色體核型為４７，ＸＹ＋１８；邋（Ｂ）１８三體細(xì)胞；（Ｃ）正常〗８、Ｘ、Ｙ逡逑細(xì)胞逡逑３３逡逑

１．７Ｄ）邋，邋Ｃａｓｅ邋３邋ＣＭＡ邋檢測(cè)結(jié)果為邋Ｉｌｑ２３＿３ｑ２５（１１６，６８１，００７－１３４，９３８，４７０）ｘ３（圖逡逑ｌ．８Ａ），２２ｑｌ邋ｌ．ｌｑｌ邋Ｉ．２１（１６，８８８．８９９－２０，３ｎ．８５８）ｘ３（圖丨．８Ｂ），與邋ＮＩＰＴ邋結(jié)果基本吻合。逡逑0３５６４０＾六檢測(cè)結(jié)果為１丨９２３．３９２５（１１６，６９６．８８６－１３４．９３８，４７０＞３（圖１．８八），逡逑２２ｑｌｌ．ｌｑｌｌ．２１（丨７，０５５，７３３－２０，３１邋ｌ，８５８）ｘ３（圖邋１．８Ｂ），胎兒核型結(jié)果均為邋４７，ＸＮ，＋ｍａｒ逡逑（圖］．９Ａ），ＦＩＳＨ分析患兒中期分裂相結(jié)果顯示２２號(hào)染色體紅色探針ＴＵＰＬＥ１逡逑（２２ｑｌｌ．２）出現(xiàn)３個(gè)信號(hào)（圖１．９Ｂ），提示多了邋１條２２號(hào)染色體，胎兒母親發(fā)生易逡逑位母親核型均為４６，ＸＸ，ｔ（ｌｌ；２２）（ｑ２３．３；２２ｑｌｌ．ｌ）（圖１．９Ｃ），母親其中一條２２號(hào)染逡逑４１逡逑

浙江大學(xué)博上學(xué)位論文邐正文第一部分ＮＩＰＴ在胎兒染色體異常中的應(yīng)用研宄逡逑色體紅色探針ＴＵＰＬＥ１信號(hào)存在而綠色探針發(fā)生易位，紅綠信號(hào)不在同一條染色逡逑體上（圖邋１．９Ｄ邋）。Ｃａｓｅ邋３邋胎兒最后分子核型邋４７，ＸＹ，邋＋ｄｅｒ（２２）邋ｍａｔ．邋ｉｓｈ邋ｄｅｒ逡逑（２２）（邋ＴＵＰＬＥ邋１＋，邋ＡＲＳＡ－）．邋ａｒｒ［ｈｇｌ９］邋１邋Ｉｑ２３．３ｑ２５（ｌ邋１６，６９６，８８６－１３４，９３８，４７０）ｘ３，逡逑２２ｑｌｌ．ｌｑｌ邋１．２１（１７，０５５，７３３－２０，３１邋ｌ，８５８）ｘ３．邋Ｃａｓｅ邋４邋胎兒最后分子核型邋４７，ＸＹ，＋ｄｅｒ（２２）逡逑ｍａｔ．邐ｉｓｈ邐ｄｅｒ邐（２２）（邐ＴＵＰＬＥ邋１＋，邐ＡＲＳＡ－）．邐ａｒｒ［ｈｇｌ９］逡逑Ｉｌｑ２３．３ｑ２５（１１６，６８１，００７－１３４，９３８，４７０）ｘ３，２２ｑｌｌ．ｌｑｌ邋１．２１（１６，８８８，８９９－２０，３１邋ｌ，８５８）ｘ３0逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｎ丨爪逡逑

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3 張t

本文編號(hào)：2818900