研究背景卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤,其中上皮性卵巢癌是最主要的病理類型。上皮性卵巢癌起病隱匿,進(jìn)展迅速,多數(shù)患者初診時(shí)已處于疾病晚期。手術(shù)治療僅對(duì)早期卵巢癌較為有效,而多數(shù)患者對(duì)常規(guī)的化療和放療不敏感,治療方法極為有限。因此,尋找卵巢癌新型靶向干預(yù)手段具有重要的臨床意義。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。UPS由泛素(ubiquitin,Ub)、26S蛋白酶體、E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶和DUBs泛素解離酶組成。其中E3泛素連接酶決定了底物的特異性選擇,是UPS的關(guān)鍵酶。目前,針對(duì)UPS的組成成分開發(fā)靶向藥物是腫瘤研究的熱點(diǎn)。TRIM(tripartite motif-containing protein)蛋白家族是一類RING型E3泛素連接酶,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是N-端含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING-finger)、B-box結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋(Coil-coiled)結(jié)構(gòu)域,其C-端結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。近年來,TRIM蛋白家族因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)大的生物學(xué)功能而受到越來越多的關(guān)注。部分TRIM家族成員通過靶向調(diào)控原癌或抑癌分子,參與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。TRIM50是近年發(fā)現(xiàn)的TRIM蛋白家族新成員。研究發(fā)現(xiàn),TRIM50參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、胃酸分泌以及細(xì)胞自噬過程。而TRIM50與腫瘤的相關(guān)報(bào)道甚少,僅有一篇報(bào)道稱TRIM50通過降解Snail抑制肝細(xì)胞性肝癌的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。TRIM50在卵巢癌中的功能至今未見報(bào)道。Src蛋白是Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)成員之一,是由原癌基因編碼的具有酪氨酸激酶活性的非受體蛋白。Src激酶的結(jié)構(gòu)由單一序列(U)、SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、連接段、SH1結(jié)構(gòu)域(蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)和竣基端調(diào)節(jié)尾端組成。Src的激活主要由羧基端調(diào)節(jié)尾端Tyr530的去磷酸化和激酶結(jié)構(gòu)域Tyr419的自磷酸化所調(diào)控。Src能夠與多種受體酪氨酸激酶和整合素相互結(jié)合并被激活,介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),在維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示,Src激酶在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等多種腫瘤中過度表達(dá)或高度激活。異常活化的Src過度激活下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt/PKB)以及信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)等信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤增殖、抵抗凋亡、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展。因此,Src是極具潛力的抗腫瘤干預(yù)靶點(diǎn),針對(duì)Src的靶向調(diào)控研究可為逆轉(zhuǎn)卵巢癌進(jìn)展提供新策略。本課題檢測(cè)了卵巢癌組織標(biāo)本中TRIM50蛋白的表達(dá)情況,并分析其臨床意義;探討了 TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性行為的影響,以及對(duì)裸鼠卵巢癌異種移植瘤生長(zhǎng)的作用效應(yīng);并深入探究TRIM50靶向調(diào)控Src蛋白的分子機(jī)制。第一部分TRIM50在卵巢癌組織中的表達(dá)和在體內(nèi)外的作用效應(yīng)的研究研究目的:1.檢測(cè)卵巢癌組織標(biāo)本中TRIM50蛋白的表達(dá)情況,分析其臨床意義。2.研究TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的影響,以及對(duì)裸鼠卵巢癌異種移植瘤生長(zhǎng)的影響。研究方法:1.研究TRIM50在卵巢癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況及其臨床意義應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(Immumohistochemical staining,IHC)檢測(cè)67例患者的卵巢漿液性腺癌組織中TRIM50蛋白的表達(dá)定位和表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析TRIM50的表達(dá)水平與疾病分期和病理分級(jí)的相關(guān)性。2探討TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的惡性行為的影響2.1構(gòu)建TRIM50功能缺失和過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型在A2780和SK-OV-3卵巢癌細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TRIM50特異性Si-RNA(Si-TRIM50),以轉(zhuǎn)染無意序列(Si-NC)的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Blank)作為對(duì)照,以此構(gòu)建TRIM50功能缺失的卵巢癌細(xì)胞模型。在A2780和SK-OV-3細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TRIM50質(zhì)粒,以轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Blank)作為對(duì)照,構(gòu)建過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型。應(yīng)用western blot分別驗(yàn)證Si-TRIM50的封閉效率和TRIM50質(zhì)粒的過表達(dá)效率。2.2研究TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的影響應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的影響。3.探討TRIM50對(duì)裸鼠卵巢癌異種移植瘤生長(zhǎng)的影響3.1構(gòu)建裸鼠卵巢癌異種移植瘤模型將卵巢癌細(xì)胞接種于雌性BALB/c裸鼠(4-6周)的兩側(cè)腋下。分別應(yīng)用SK-OV-3和A2780細(xì)胞系構(gòu)建兩種人卵巢癌細(xì)胞系來源的裸鼠異種移植瘤模型。3.2研究TRIM50對(duì)卵巢癌異種移植瘤生長(zhǎng)的影響待裸鼠兩側(cè)腋下出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤后,在右側(cè)瘤內(nèi)注射TRIM50質(zhì)粒(30μg),在左側(cè)瘤內(nèi)注射空載體(30μg)作為對(duì)照,每2天注射一次。定期記錄腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。處死裸鼠后取瘤體,比較各組腫瘤的體積和重量。研究結(jié)果:1.TRIM50在卵巢癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義應(yīng)用IHC檢測(cè)67例卵巢漿液性腺癌組織標(biāo)本中TRIM50蛋白的表達(dá)定位和表達(dá)水平。結(jié)果顯示,TRIM50主要定位于卵巢癌細(xì)胞的胞漿。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與FIGO Ⅰ期患者的卵巢癌組織相比,FIGO Ⅱ、Ⅲ和ⅣV期患者的卵巢癌組織中TRIM50的表達(dá)水平顯著下調(diào)。與病理呈G1級(jí)(高分化)的卵巢癌組織相比,G2級(jí)(中分化)和G3級(jí)(低分化)的卵巢癌組織中TRIM50的表達(dá)水平顯著降低。相關(guān)性分析顯示TRIM50在卵巢癌組織中的表達(dá)水平與疾病分期和病理分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)。表明TRIM50的表達(dá)下調(diào)可能參與了卵巢癌的惡性進(jìn)展。2.TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的影響分別構(gòu)建TRIM50功能缺失和過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型,應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的惡性行為。結(jié)果顯示,敲低TRIM50表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移能力顯著上調(diào);過表達(dá)TRIM50后,卵巢癌細(xì)胞的這些惡性行為被顯著抑制。表明TRIM50在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌效應(yīng)。3.TRIM50對(duì)裸鼠卵巢癌異種移植瘤生長(zhǎng)的影響構(gòu)建裸鼠卵巢癌異種移植瘤模型,在裸鼠右側(cè)腋下腫瘤中注射TRIM50質(zhì)粒,在左側(cè)腋下瘤內(nèi)注射等量空載體作為對(duì)照。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示,與對(duì)照組相比,注射TRIM50質(zhì)粒后卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。剝離瘤體后測(cè)量發(fā)現(xiàn)注射TRIM50質(zhì)粒后腫瘤的重量和體積顯著小于對(duì)照組。表明TRIM50抑制裸鼠卵巢癌異種移植瘤的生長(zhǎng),在體內(nèi)水平驗(yàn)證了 TRIM50的抑癌效應(yīng)。研究結(jié)論:1.TRIM50在卵巢癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平與卵巢癌臨床分期和病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。2.TRIM50顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移能力,并顯著抑制裸鼠卵巢癌異種移植瘤的生長(zhǎng)。第二部分TRIM50對(duì)Src蛋白的結(jié)合及調(diào)控效應(yīng)的研究研究目的:1.篩選TRIM50的作用靶點(diǎn),研究TRIM50與靶蛋白Src的直接結(jié)合效應(yīng)以及介導(dǎo)二者結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。2.探討卵巢癌細(xì)胞中TRIM50對(duì)Src蛋白的調(diào)控效應(yīng),以及TRIM50通過調(diào)控Src發(fā)揮抑癌效應(yīng)的機(jī)制。研究方法:1.研究TRIM50與Src蛋白的直接相互作用1.1 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitation,IP)應(yīng)用IP實(shí)驗(yàn)篩選可能與TRIM50相互結(jié)合的原癌或抑癌分子,發(fā)現(xiàn)TRIM50與原癌分子Src相互結(jié)合,表明Src蛋白可能是TRIM50發(fā)揮抑癌效應(yīng)的作用靶點(diǎn)。1.2共定位實(shí)驗(yàn)在卵巢癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染TRIM50與Src質(zhì)粒,進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TRIM50與Src蛋白的共定位現(xiàn)象。1.3蛋白體外翻譯實(shí)驗(yàn)通過蛋白體外翻譯實(shí)驗(yàn)分別合成TRIM50和Src蛋白,應(yīng)用IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)合成的TRIM50和Src蛋白在體外的直接結(jié)合。2.探討介導(dǎo)TRIM50與Src蛋白相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域2.1研究介導(dǎo)TRIM50與Src結(jié)合的TRIM50蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一系列TRIM50結(jié)構(gòu)域缺失的截短體,將Src質(zhì)粒分別與各個(gè)TRIM50截短體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,以共轉(zhuǎn)染Src與野生型TRIM50質(zhì)粒的細(xì)胞作為陽性對(duì)照。IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各TRIM50截短體與Src的結(jié)合,研究TRIM50蛋白結(jié)構(gòu)中介導(dǎo)二者結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。2.2研究介導(dǎo)Src與TRIM50結(jié)合的Src蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一系列Src結(jié)構(gòu)域缺失的截短體,將TRIM50質(zhì)粒分別與各個(gè)Src截短體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,以共轉(zhuǎn)染TRIM50與野生型Src質(zhì)粒的細(xì)胞作為陽性對(duì)照。通過IP實(shí)驗(yàn)研究Src蛋白結(jié)構(gòu)中介導(dǎo)二者結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。3.研究卵巢癌中TRIM50對(duì)Src蛋白的調(diào)控作用3.1 Western blot 實(shí)驗(yàn)在卵巢癌細(xì)胞中敲低和過表達(dá)TRIM50,western blot檢測(cè)TRIM50、Src及其活化形式p-Src(Tyr419)的蛋白水平,研究TRIM50對(duì)Src蛋白水平的調(diào)控作用。3.2 放線菌酮(Cycloheximide,CHX)實(shí)驗(yàn)在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIM50質(zhì)粒,以轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照,轉(zhuǎn)染24 h后應(yīng)用CHX阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白合成,設(shè)立CHX作用時(shí)間梯度(0h、2h、4h、6h和8 h),western blot檢測(cè)Src蛋白的降解趨勢(shì),研究TRIM50對(duì)Src降解的調(diào)控效應(yīng)。3.3通過檢測(cè)裸鼠卵巢癌異種移植瘤驗(yàn)證TRIM50對(duì)Src的調(diào)控效應(yīng)提取裸鼠卵巢癌異種移植瘤的蛋白,western blot檢測(cè)瘤體中TRIM50、Src和p-Src(Tyr419)的表達(dá)水平,驗(yàn)證腫瘤內(nèi)TRIM50的過表達(dá)效率,應(yīng)用動(dòng)物模型驗(yàn)證TRIM50對(duì)Src的調(diào)控效應(yīng)。3.4通過檢測(cè)卵巢癌組織標(biāo)本驗(yàn)證TRIM50對(duì)Src的調(diào)控效應(yīng)應(yīng)用IHC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢漿液性腺癌組織標(biāo)本中Src和TRIM50的蛋白水平,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Src與TRIM50蛋白水平的相關(guān)性,應(yīng)用臨床標(biāo)本驗(yàn)證TRIM50對(duì)Src的調(diào)控效應(yīng)。4.研究卵巢癌細(xì)胞中TRIM50介導(dǎo)Src蛋白降解的途徑真核細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解途徑主要有溶酶體途徑和泛素蛋白酶體途徑。在過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型中,分別應(yīng)用MG132和氯喹抑制蛋白酶體和溶酶體活性,western blot檢測(cè)Src蛋白水平,研究阻斷蛋白酶體或溶酶體活性對(duì)TRIM50降解Src功能的影響,探討TRIM50介導(dǎo)Src降解的途徑。5.探討TRIM50通過調(diào)控Src在卵巢癌中發(fā)揮抑癌效應(yīng)的機(jī)制在過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞中外源性轉(zhuǎn)染Src質(zhì)粒,應(yīng)用western blot驗(yàn)證外源性過表達(dá)效率,transwell和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和克隆形成能力,通過靶點(diǎn)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)研究TRIM50是否通過負(fù)向調(diào)控Src發(fā)揮抑癌效應(yīng)。研究結(jié)果:1.TRIM50與Src蛋白直接結(jié)合的研究1.1 TRIM50與Src蛋白的相互結(jié)合應(yīng)用IP實(shí)驗(yàn)篩選可能與TRIM50發(fā)生結(jié)合的原癌或抑癌分子,結(jié)果顯示在HEK293T和卵巢癌細(xì)胞中TRIM50與原癌分子Src相互結(jié)合,TRIM50與外源性和內(nèi)源性Src蛋白均能發(fā)生結(jié)合,表明Src可能是TRIM50的作用靶點(diǎn)。1.2 TRIM50與Src蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的共定位現(xiàn)象在卵巢癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染TRIM50和Src質(zhì)粒,應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM50和Src蛋白在卵巢癌細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象,進(jìn)一步驗(yàn)證了 TRIM50與Src的相互結(jié)合。1.3 TRIM50與Src蛋白的直接結(jié)合在蛋白體外翻譯系統(tǒng)中分別合成TRIM50和Src蛋白,IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在單純的體外系統(tǒng)中合成的TRIM50和Src蛋白能夠發(fā)生直接結(jié)合。2.介導(dǎo)TRIM50與Src蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的研究2.1介導(dǎo)TRIM50與Src結(jié)合的TRIM50蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一系列TRIM50結(jié)構(gòu)域缺失的截短體,將Src質(zhì)粒分別與各個(gè)TRIM50截短體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,B-box2結(jié)構(gòu)域缺失后TRIM50喪失結(jié)合Src的功能,表明TRIM50通過B-box2結(jié)構(gòu)域與Src蛋白發(fā)生結(jié)合。2.2介導(dǎo)Src與TRIM50結(jié)合的Src蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)建一系列Src結(jié)構(gòu)域缺失的截短體,在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染TRIM50質(zhì)粒與各個(gè)Src截短體。IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SH3結(jié)構(gòu)域缺失后Src無法與TRIM50結(jié)合,表明Src通過SH3結(jié)構(gòu)域與TRIM50蛋白發(fā)生結(jié)合。3.卵巢癌中TRIM50對(duì)Src蛋白的調(diào)控效應(yīng)3.1 TRIM50對(duì)Src蛋白水平的調(diào)控效應(yīng)前期研究證實(shí)了 TRIM50與Src蛋白發(fā)生直接結(jié)合,我們擬進(jìn)一步探究TRIM50對(duì)Src蛋白的調(diào)控效應(yīng)。在卵巢癌細(xì)胞中敲低和過表達(dá)TRIM50,western blot結(jié)果顯示,敲低TRIM50表達(dá)后,Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平顯著上調(diào);過表達(dá)TRIM50后,Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平顯著下調(diào),表明TRIM50負(fù)向調(diào)控Src,顯著抑制Src活性。3.2 TRIM50對(duì)Src蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控效應(yīng)將TRIM50質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞中,以轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照,應(yīng)用放線菌酮阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成,western blot檢測(cè)Src蛋白的降解趨勢(shì)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過表達(dá)TRIM50后Src蛋白的降解速率顯著上調(diào),表明TRIM50能夠降低Src蛋白的穩(wěn)定性,促進(jìn)Src蛋白降解。3.3應(yīng)用裸鼠卵巢癌異種移植瘤驗(yàn)證TRIM50對(duì)Src蛋白的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)Western blot檢測(cè)裸鼠卵巢癌異種移植瘤中TRIM50、Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平。結(jié)果顯示,注射TRIM50質(zhì)粒的腫瘤中TRIM50成功過表達(dá),并且在TRIM50過表達(dá)的腫瘤中Src和p-Src(Tyr419)蛋白水平顯著下調(diào),這在動(dòng)物模型水平驗(yàn)證了 TRIM50對(duì)Src的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)。3.4 卵巢癌組織標(biāo)本中Src與TRIM50蛋白水平的相關(guān)性應(yīng)用IHC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢漿液性腺癌組織標(biāo)本中Src和TRIM50蛋白的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示Src與TRIM50的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān),這在臨床標(biāo)本水平驗(yàn)證了 TRIM50對(duì)Src的負(fù)向調(diào)控效應(yīng)。4.卵巢癌細(xì)胞中TRIM50介導(dǎo)Src蛋白降解的途徑在過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型中,分別應(yīng)用MG132和氯喹阻斷蛋白酶體和溶酶體的活性,western blot結(jié)果顯示,MG132能夠阻斷TRIM50對(duì)Src的降解作用,而氯喹并不影響TRIM50降解Src的功能,表明TRIM50對(duì)Src蛋白的降解作用依賴于蛋白酶體途徑而非溶酶體途徑。5.TRIM50通過調(diào)控Src蛋白在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌效應(yīng)的機(jī)制研究基于前期研究證實(shí)了 TRIM50的抑癌效應(yīng)及其負(fù)向調(diào)控Src的功能,我們擬通過靶點(diǎn)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)探討TRIM50是否通過負(fù)向調(diào)控Src發(fā)揮抑癌效應(yīng)。在過表達(dá)TRIM50的卵巢癌細(xì)胞模型中外源性轉(zhuǎn)染Src質(zhì)粒。Western blot結(jié)果顯示各質(zhì)粒的成功過表達(dá),克隆形成實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性過表達(dá)Src能夠逆轉(zhuǎn)TRIM50對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用,表明TRIM50通過負(fù)向調(diào)控Src蛋白在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌效應(yīng)。研究結(jié)論:1.TRIM50直接靶向結(jié)合Src蛋白,TRIM50的B-box2結(jié)構(gòu)域與Src的SH3結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)了二者的結(jié)合。2.卵巢癌細(xì)胞中TRIM50通過蛋白酶體途徑降解Src蛋白,TRIM50通過降解Src發(fā)揮抑癌效應(yīng)。第三部分卵巢癌細(xì)胞中TRIM50調(diào)控Src的分子機(jī)制研究研究目的:1.研究TRIM50對(duì)Src蛋白的泛素化修飾作用。2.研究RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化降解Src蛋白和發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的功能。研究方法:1.探討TRIM50對(duì)Src蛋白的泛素化修飾作用1.1泛索化分析實(shí)驗(yàn)在卵巢癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染帶HA標(biāo)簽的Ub質(zhì)粒(HA-Ub)和TRIM50質(zhì)粒,以共轉(zhuǎn)染HA-Ub與空載體的細(xì)胞作為對(duì)照,IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài),研究TRIM50對(duì)Src的泛素化修飾作用。1.2體外泛素化實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白體外翻譯系統(tǒng)合成TRIM50和Src蛋白,將合成的TRIM50和Src蛋白與Ub、UBE1、UbcH5a(UBE2D1)、ATP和MgCl2共同孵育,構(gòu)成體外泛素化系統(tǒng)。Western blot檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài),探討TRIM50的E3泛素連接酶功能。2.檢測(cè)TRIM50介導(dǎo)Src蛋白泛素化修飾的類型HA-Ub-K48和HA-Ub-K63質(zhì)粒是泛素突變體載體,除了分別位于第48和63位的賴氨酸殘基以外,其他賴氨酸殘基均被精氨酸取代。在HEK293T和SK-OV-3細(xì)胞中分別將HA-Ub-K48、HA-Ub-K63與TRIM50質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài),研究TRIM50介導(dǎo)Src泛素化修飾的類型。3.研究RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化降解Src和發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的作用3.1研究RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化修飾Src蛋白過程中的作用將HA-Ub與RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體共轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞中,以共轉(zhuǎn)染HA-Ub與野生型TRIM50質(zhì)粒的細(xì)胞作為陽性對(duì)照,以共轉(zhuǎn)染HA-Ub與空載體的細(xì)胞作為陰性對(duì)照,應(yīng)用IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài),探討RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化修飾Src蛋白過程中的作用。3.2探討RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50負(fù)向調(diào)控Src過程中的功能在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體,分別以轉(zhuǎn)染野生型TRIM50質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。Western blot檢測(cè)細(xì)胞的Src、p-Src(Tyr419)蛋白水平,研究RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50負(fù)向調(diào)控Src過程中的功能。3.3探討RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的作用分別在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體、野生型TRIM50質(zhì)粒和空載體對(duì)照。Transwell和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和克隆形成能力,研究RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的作用。研究結(jié)果:1.卵巢癌細(xì)胞中TRIM50介導(dǎo)Src蛋白發(fā)生泛素化修飾的研究1.1 TRIM50介導(dǎo)Src蛋白泛素化修飾的功能將HA-Ub與TRIM50質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞中,以共轉(zhuǎn)染HA-Ub與空載體的細(xì)胞作為對(duì)照,IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化修飾狀態(tài)。結(jié)果顯示TRIM50能夠?qū)⒎核劓溙砑拥絊rc蛋白上,介導(dǎo)Src發(fā)生泛素化修飾。1.2 TRIM50的E3泛素連接酶活性的檢測(cè)將在蛋白體外翻譯系統(tǒng)中合成的TRIM50和Src蛋白與Ub、UBE1、UbcH5a(UBE2D1)、ATP和MgCl2共同孵育,構(gòu)成體外泛素化系統(tǒng),western blot檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài)。結(jié)果顯示在單純的體外系統(tǒng)中TRIM50能夠?qū)⒎核劓溙砑釉赟rc蛋白上,表明TRIM50是直接介導(dǎo)Src泛素化的E3泛素連接酶。2.TRIM50介導(dǎo)Src蛋白泛素化修飾的類型K48和K63位泛素化修飾是機(jī)制較明確的泛素化修飾類型。在HEK293T和SK-OV-3細(xì)胞中,將TRIM50質(zhì)粒分別與HA-Ub-K48和HA-Ub-K63質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài)。結(jié)果顯示,TRIM50介導(dǎo)Src發(fā)生K48位泛素化修飾,進(jìn)一步驗(yàn)證了 TRIM50通過泛素蛋白酶體途徑介導(dǎo)Src的降解。3.RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化降解Src和發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的功能研究3.1 RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50泛素化修飾Src蛋白過程中的作用將HA-Ub分別與RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體、野生型TRIM50質(zhì)粒(陽性對(duì)照)和空載體(陰性對(duì)照)共轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞中,IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src的泛素化狀態(tài)。結(jié)果顯示RING結(jié)構(gòu)域缺失后TRIM50無法為Src蛋白加上泛素鏈,表明TRIM50通過RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Src的泛素化修飾。3.2 RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50負(fù)向調(diào)控Src過程中的作用在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體,分別以轉(zhuǎn)染野生型TRIM50質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照,western blot檢測(cè)Src和p-Src(Tyr419)蛋白水平。結(jié)果顯示,TRIM50的RING結(jié)構(gòu)域缺失突變體失去下調(diào)Src和p-Src(Tyr419)的功能,表明TRIM50依賴RING結(jié)構(gòu)域發(fā)揮負(fù)向調(diào)控Src的作用。3.3 RING結(jié)構(gòu)域在TRIM50發(fā)揮抑癌效應(yīng)過程中的功能分別在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RING結(jié)構(gòu)域缺失的TRIM50截短體、野生型TRIM50質(zhì)粒和空載體對(duì)照,transwell和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力和克隆形成能力。結(jié)果顯示,RING結(jié)構(gòu)域缺失后,TRIM50失去了抑制卵巢癌細(xì)胞惡性行為的功能,表明TRIM50的抑癌效應(yīng)是依賴RING結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮的。研究結(jié)論:1.卵巢癌細(xì)胞中TRIM50通過E3泛素連接酶活性介導(dǎo)Src蛋白發(fā)生K48位泛素化修飾,通過泛素蛋白酶體途徑降解Src蛋白。2.卵巢癌細(xì)胞中TRIM50依賴RING結(jié)構(gòu)域泛素化降解Src蛋白和發(fā)揮抑癌效應(yīng)。課題的創(chuàng)新性和局限性課題的創(chuàng)新性:1.對(duì)TRIM50在卵巢癌中的功能進(jìn)行研究,并分析TRIM50的表達(dá)水平與疾病分期和病理分級(jí)的相關(guān)性,為探索卵巢癌新型治療靶標(biāo)和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)提供依據(jù)。2.提出TRIM50對(duì)Src蛋白的靶向抑制效應(yīng),揭示了 TRIM50通過泛素蛋白酶體途徑降解Src蛋白,為探究Src的調(diào)控機(jī)制和開發(fā)新型Src抑制劑奠定基礎(chǔ)。3.探索了 TRIM50靶向調(diào)控Src和發(fā)揮抑癌效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,為明確TRIM50的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)和設(shè)計(jì)基于TRIM50結(jié)構(gòu)域的小分子化合物提供理論依據(jù)。課題的局限性:1.本課題納入的臨床卵巢癌標(biāo)本數(shù)量有待進(jìn)一步擴(kuò)大,從而使不同分期的標(biāo)本數(shù)分布更均。組織標(biāo)本來源年份較早,故采用G1、G2和G3病理分級(jí)方法。2.TRIM50其他結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil、PRY-SPRY結(jié)構(gòu)域)的功能有待研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R737.31
【部分圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑組織相比，ＦＩＧＯ邋ＩＩ、ＩＩＩ和ＩＶ期患者的卵巢癌組織中ＴＲＩＭ５０蛋白水平顯著下調(diào)逡逑（尸＜０．０５，圖１Ａ－Ｂ，表２）。與病理呈Ｇ１級(jí)（高分化）的卵巢癌組織相比，逡逑Ｇ２級(jí)（中分化）和Ｇ３級(jí)（低分化）的卵巢癌組織中ＴＲＩＭ５０的表達(dá)水平顯著逡逑下調(diào)（戶＜０．００１，圖１Ｃ－Ｄ，表２）。相關(guān)性分析顯示ＴＲＩＭ５０在卵巢癌組織中的逡逑表達(dá)水平與疾病分期和病理分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)＜０．０５，邋Ｐ＜０．０１，表３）。表明逡逑ＴＲＩＭ５０的表達(dá)下調(diào)可能參與了卵巢癌的惡性進(jìn)展。逡逑

載體的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（Ｂｌａｎｋ）作為對(duì)照，構(gòu)建過表達(dá)ＴＲＩＭ５０的卵巢癌逡逑細(xì)胞模型。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證Ｓｉ－ＴＲＩＭ５０的封閉效率和ＴＲＩＭ５０質(zhì)粒的逡逑過表達(dá)效率（圖２Ａ－Ｂ）。逡逑２．２邐ＴＲＩＭ５０對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響逡逑應(yīng)用ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＴＲＩＭ５０對(duì)Ａ２７８０和ＳＫ－ＯＶ－３細(xì)胞增殖能力的影響。逡逑結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低ＴＲＩＭ５０表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的增殖水平顯著上調(diào)逡逑（尸＜０．００１，圖２Ｃ）；過表達(dá)ＴＲＩＭ５０后卵巢癌細(xì)胞的增殖水平明顯低于對(duì)照逡逑組（尸＜０．００１，圖２Ｄ）。表明ＴＲＩＭ５０顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。逡逑Ａ邐８逡逑＾２７８０邐ＳＫ－ＯＶ－３邐Ａ２７８０邐ＳＫ－ＯＶ－３逡逑Ｂｌａｎｋ邐？邐Ｂｌａｎｋ邐？邐Ｂｌａｎｋ邐？邐Ｂｌａｎｋ邐？邐．逡逑Ｓ？＊ＮＣ邐？邐８Ｍ４Ｃ邐？邐Ｆｌａｇ－ｐＣＭＶ邐？邐Ｆｌａｇ＾ｐＣＭＶ邋．邐？邐？逡逑８＾ＴＲＩＭ５０邐？邐？邐ＳＩ－ＴＲＩＭ５０邐？邐ＦＩ？ｇ－ＴＲＩＭＳＯ邋？邐？邐？邐Ｆｌａｇ－ＴＲＩＭ５０邋■邐？逡逑ＴＷＭ５０邋■■運(yùn)．５５ｋ0邋ＴＲＩＭ５０邐５５ＫＤ邐Ｆｌａｇ邋｜邐ｊ＾ｊ．ＳＳＫＤ邋Ｆｌａｇ邋｜邐＾Ｆ｜－５５ＫＤ逡逑ｐ－ａｃｔｌｎ邐ｍｍｍｒ邋？？？邋４２ＫＤ邋ｐｅｃｔｉｎ邐ＭＶ邋？邋４２Ｋ０邐ｐ－ｏｃｔｌｎ邐．４２ＫＤ邋ｐｅｃｔｉｎ逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑Ａ２７８０邐ＳＫ－ＯＶ－３邐Ａ２７８０邐ＳＫ－ＯＶ－３逡逑＊￣邐２．0

應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＴＲＩＭ５０對(duì)Ａ２７８０和ＳＫ－ＯＶ－３細(xì)胞克隆形成能力的逡逑影響。結(jié)果顯示，敲低ＴＲＩＭ５０表達(dá)后形成的細(xì)胞克隆數(shù)明顯增多（Ｐ邋＜０．０５，逡逑圖３Ａ）；過表達(dá)ＴＲＩＭ５０后形成的細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少（ＰＯ．ＯＳ，戶＜０．０１，圖逡逑３Ｂ）。表明ＴＲＩＭ５０顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的克隆形成能力。逡逑Ａ邐Ｂｌａｎｋ邐Ｓｉ－ＮＣ邐ＳＩ－ＴＲＩＭ５０逡逑ａ邋ｉ逡逑ＳＫ＾ｆｒ�。祝у义希逻姡拢欤幔睿脒姡停铮悖脒姡裕遥桑停担板义希麇�？邐５邋ＷＭ邋５邋0Ｕｉ�。蹂义蠄D３邋ＴＲ１Ｍ５０對(duì)卵巢癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。逡逑（Ａ）

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