【摘要】：目的:觀察母親孕前患2型糖尿病合并肥胖對胎盤線粒體功能及其后代代謝紊亂的影響。體外模擬高糖及高脂環(huán)境,觀察其對人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。方法:1.選取健康孕婦,單純孕前2型糖尿病孕婦,單純孕前肥胖孕婦,孕前2型糖尿病合并肥胖孕婦作為研究對象,每組各24例。記錄母親年齡、孕前體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、孕期體質(zhì)量增長、胎齡等參數(shù)。收集各組孕婦娩出的胎盤組織,分離胎盤線粒體。采用試劑盒分別測定四組胎盤的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、線粒體含量、ATP水平、線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性。提取各組胎盤線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA),采用RT-PCR法檢測胎盤線粒體DNA表達(dá)水平。應(yīng)用免疫熒光染色和western blot測定各組胎盤組織Nrf2及HO-1的表達(dá)。2.選取健康孕婦,單純孕前2型糖尿病孕婦,單純孕前肥胖孕婦,孕前2型糖尿病合并肥胖孕婦及其新生兒作為研究對象,每組各40例。記錄新生兒出生體質(zhì)量、胎齡等參數(shù)。收集四組孕婦其胎盤娩出后臍靜脈血。根據(jù)試劑盒操作說明檢測新生兒臍帶血中抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、胰島素、血糖、瘦素(Leptin,LEP)、游離脂肪酸(Nonesterified fatty acid,NEFA)、脂聯(lián)素(adiponectin,ADP)、甘油三酯,并用采用線性回歸分析探討每組胎兒臍血MDA、CAT、GSH-PX與新生兒臍血血清學(xué)代謝指標(biāo)胰島素、血糖、LEP、NEFA、ADP、甘油三酯的相互關(guān)系。3.對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)及傳代,在對數(shù)生長期收集胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。將胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分為4組進(jìn)行不同的處理。即分為高糖處理組-HG(high glucose)(30mmol/L葡萄糖處理)、高脂處理組-HL(high lipids)(0.3mmol/L棕櫚酸處理組)、高糖合并高脂處理組-HG/HL以及空白對照組-CON。采用CCK-8試劑檢測各組胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖情況。檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)24,48和72小時(shí)后超氧化物歧化酶(reactive oxygen species,SOD)水平、MDA活性及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平。采用TUNEL法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后的凋亡率。透射電鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)變化。檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性。Western blot及免疫熒光檢測各組細(xì)胞線粒體損傷及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、SMAC、Cyt-C的表達(dá)情況。結(jié)果:1.四組之間母親年齡、胎齡之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。孕前肥胖組和孕前糖尿病合并肥胖組的體質(zhì)量、BMI以及孕期體質(zhì)量增長明顯高于對照組和孕前糖尿病組(P0.05)。孕前糖尿病組體質(zhì)量、BMI及孕期體質(zhì)量增長均高于對照組(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組的ROS水平、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)水平高于對照組、孕前糖尿病組以及孕前肥胖組(P0.05)。對照組、孕前糖尿病組以及孕前肥胖組的SOD水平顯著高于孕前糖尿病合并肥胖組(P0.05)。此外孕前糖尿病組的SOD水平明顯低于對照組以及孕前肥胖組(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組的ATP水平顯著低于對照組、孕前糖尿病組及孕前肥胖組(P0.05)。除此之外,孕前糖尿病合并肥胖組mt DNA的拷貝數(shù)也明顯低于其他各組(P0.05)。孕前糖尿病組的mt DNA拷貝數(shù)低于對照組、孕前肥胖組(P0.05)。孕前肥胖組mtDNA拷貝數(shù)顯著低于對照組mt DNA拷貝數(shù)(P0.05)。孕前糖尿病組的mt DNA拷貝數(shù)低于對照組、孕前肥胖組(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性明顯低于對照組、孕前肥胖組和孕前糖尿病組(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組和孕前糖尿病組的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ*Ⅲ活性也比對照組更低(P0.05),而孕前糖尿病合并肥胖組和孕前糖尿病組之間、對照組和肥胖組之間線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ*Ⅲ活性均無顯著差異(P0.05)。復(fù)合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性在四組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Western blot檢測顯示孕前糖尿病合并肥胖組、孕前糖尿病組的Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)明顯低于對照組和孕前肥胖組(P0.05)。2.孕前糖尿病合并肥胖組臍血抗氧化劑CAT與GSH-PX水平顯著低于其余各組(P0.05),孕前糖尿病合并肥胖組MDA水平顯著高于其余各組(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組比孕前糖尿病和對照組中的臍血胰島素、LEP、NEFA和ADP水平明顯增高(P0.05)。然而四組之間臍血葡萄糖和甘油三酯水平無明顯差異(P0.05)。孕前糖尿病合并肥胖組中,臍血LEP水平與抗氧化劑CAT、GSH-PX,以及MDA均存在相關(guān)性(P0.05),ADP與抗氧化劑CAT、GSH-PX存在相關(guān)性(P0.05)。而且回歸分析顯示孕前糖尿病合并肥胖組,LEP與CAT、GSH-PX水平成負(fù)相關(guān),LEP與MDA水平成正相關(guān)(P0.05);脂聯(lián)素與CAT、GSH-PX水平成負(fù)相關(guān)(P0.05)。四組中胰島素和NEFA與CAT、GSH-PX、MDA均無明顯相關(guān)性(P0.05)。3.CCK-8檢測顯示在24、48及72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn),四組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。并且對照組的細(xì)胞數(shù)量顯著高于高脂組及高糖合并高脂組(P0.05),而高糖和高糖合并高脂組的細(xì)胞數(shù)量在24小時(shí)時(shí)則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。高糖、高脂及高糖合并高脂組細(xì)胞LDH滲漏均顯著高于對照組,并且高脂組滲漏在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)也均高于高糖組(P0.05),高糖合并高脂組細(xì)胞的LDH滲漏最顯著。對照組細(xì)胞的SOD水平在24、48及72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于其余三組(P0.05),而高糖合并高脂組的的SOD水平顯著低于其余各組(P0.05)。對照組細(xì)胞的MDA水平均顯著低于其余三組(P0.05),而高糖合并高脂組的的MDA水平顯著高于其余各組(P0.05)。對照組的細(xì)胞凋亡率僅為1.1%,而高糖合并高脂組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)35.2%,顯著高于其余各組(P0.05)。高糖合并高脂組的線粒體復(fù)合物Ⅰ及Ⅳ的活性顯著低于其余三組(P0.05),而高糖與高脂組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。高糖合并高脂組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的Nrf2及HO-1蛋白均顯著低于其余三組(P0.05),而高糖組及高脂組的Nrf2及HO-1蛋白相對表達(dá)量也有所下降,且均低于對照組(P0.05)。高糖合并高脂組的線粒體中SMAC、Cyt-C相對表達(dá)最低(P0.05),而高糖、高脂組的細(xì)胞線粒體中SMAC、Cyt-C較對照組也有顯著的下降,但仍高于高糖合并高脂組(P0.05)。高糖合并高脂組的細(xì)胞線粒體損傷較其余各組更為明顯,存在線粒體腫脹,局部萎縮,線粒體膜不完整等表現(xiàn)。結(jié)論:1.孕前糖尿病能夠通過抑制Nrf2/ARE通路(抗氧化反應(yīng)元件)損害孕婦胎盤氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)功能,引起胎盤線粒體功能損傷。而孕前肥胖則更進(jìn)一步加重孕前糖尿病對孕婦胎盤的氧化應(yīng)激損傷。2.母親孕前糖尿病合并肥胖能夠影響其后代糖代謝及脂代謝。并且孕前糖尿病合并肥胖者后代的氧化應(yīng)激與其脂質(zhì)代謝指標(biāo)相關(guān)。3.高糖和高脂都能夠?qū)μケP滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,而高糖/高脂兩種因素同時(shí)刺激對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的損傷更明顯,并且這一損傷可能通過抑制Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R714.256;R72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2805106