【摘要】：目的:研究不同濃度雌二醇(estradiol,E_2)對體外培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)增殖、凋亡的影響,探索hAMSCs分化為子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞的潛能及條件。方法:(1)采用組織貼壁法和改良酶消化法提取hAMSCs;通過流式細(xì)胞學(xué)和免疫熒光對第3代hAMSCs進(jìn)行鑒定。酶消化法提取人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hEStCs),通過免疫熒光對h EStCs進(jìn)行鑒定。(2)采用不同濃度E_2作用于h AMSCs;CCK8(cell counting kit-8,CCK8)試劑盒測定各組hAMSCs的增殖情況;實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)檢測細(xì)胞分化、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況;蛋白印跡法(Western blotting,WB)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。(3)采用條件誘導(dǎo)培養(yǎng)基和transwell共培養(yǎng)方法分別分組培養(yǎng)第3代h AMSCs,培養(yǎng)7天后,qRT-PCR檢測上皮特異性基因(CK7、EMA),間質(zhì)特異性基因(Vimentin),蛻膜化標(biāo)志基因(IGFBP-1)的表達(dá)情況,進(jìn)一步采用WB檢測上皮特異性蛋白(CK18),間質(zhì)特異蛋白(Vimentin),蛻膜化標(biāo)志性蛋白(PRL)的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)通過改良酶消化法提取、傳代,獲得大量純化可穩(wěn)定增殖的hAMSCs用于后續(xù)研究。(2)各濃度E_2組在1-4天的增殖率與對照組無明顯差異,在4天后,各濃度E_2組的增殖率明顯高于對照組(p0.05),各濃度組間無明顯差異;1×10~(-6)mol/l E_2組hAMSCs的干細(xì)胞相關(guān)基因(Oct-4)、抗凋亡基因(Bcl-2)表達(dá)水平較對照組和其他E_2濃度組上調(diào)(p0.05),1×10~(-5)mol/l E_2組hAMSCs的促凋亡基因(Bax)較對照組和其他E_2濃度組上調(diào)(p0.05);1×10~(-6)mol/l E_2組hAMSCs的促凋亡蛋白(Bax)較其他濃度E_2組顯著下調(diào)(P0.001)。(3)細(xì)胞因子組和細(xì)胞因子+E_2組hAMSCs的細(xì)胞形態(tài)由原本的粗短梭形變?yōu)榧?xì)長梭形;細(xì)胞因子組hAMSCs的上皮特異性基因(CK7、EMA)較對照組表達(dá)上調(diào)(P0.05),細(xì)胞因子組和細(xì)胞因子+E_2組hAMSCs的上皮特異性蛋白(CK18)、蛻膜化標(biāo)志性蛋白(PRL)較對照組顯著上調(diào)(P0.01),而間質(zhì)特異性蛋白(Vimentin)較對照組顯著下調(diào)(P0.01);共培養(yǎng)組hAMSCs的上皮特異性基因(CK7)、蛻膜化標(biāo)志性基因(IGFBP1)較對照組表達(dá)上調(diào)(P0.05),而間質(zhì)特異性基因(Vimentin)較對照組表達(dá)下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:(1)改良酶消化法可獲取大量hAMSCs;(2)E_2促進(jìn)hAMSCs的增殖呈時間依賴性,高濃度E_2(10~(-5)mol/l)促進(jìn)hAMSCs凋亡,較高濃度E_2(10~(-6)mol/l)能夠維持hAMSCs活性并保護(hù)其分化潛能;(3)hAMSCs在細(xì)胞因子(TGF-β1+EGF+PDGF-BB)或transwell共培養(yǎng)h EStCs所提供的微環(huán)境中能夠向子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分化,而E_2對這種分化效應(yīng)的作用并不顯著。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R711.74
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.2 鑒定分離提取的 hAMSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測第 3 代 hAMSCs，結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)記 CD29、CD90 表達(dá)率分別為 98.17 ±0.76%、98.83±0.68%；造血干細(xì)胞表面標(biāo)記 CD45 表達(dá)率為 0.05±0.49%(圖 2 C)；免疫熒光法檢測第 3 代 hAMSCs 的 Vimentin、CK18 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示 Vimentin 表達(dá)陽性，CK18 表達(dá)陰性(圖 2A、B)。

鼠或兔的二抗(1：5000 稀釋)，室溫孵育 1 小時，TBST 洗 3 次，ECL 熒色，暗室中用高敏感 X 線膠片曝光顯影。統(tǒng)計學(xué)分析計方法同第二部分。果胞因子聯(lián)合 E2誘導(dǎo) hAMSCs 后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變置相差顯微鏡下觀察顯示：hAMSCs 在誘導(dǎo)分化組(細(xì)胞因子、細(xì)胞因子+形態(tài)發(fā)生較大改變，細(xì)胞由原本的粗短梭形的成纖維細(xì)胞樣變?yōu)榧?xì)長的，呈放射狀分布，增殖能力較對照組更好。hAMSCs 在只添加 E2組的細(xì)對照組變化不明顯(圖 7)。

37A、上皮細(xì)胞特異基因 CK7 的 mRNA 表達(dá)；B、間質(zhì)細(xì)胞特異基因 Vimentin 的 mRNA 表達(dá)；C、蛻膜化標(biāo)記物 IGFBP-1 的 mRNA 表達(dá)。注：*為 P＜0.05；**為 P＜0.01.圖 10: Transwell 共培養(yǎng) hEStCs 誘導(dǎo) hAMSCs 分化后基因表達(dá)情況Fig.10：The mRNA expression of hAMSCs by by co-culture with hEStCs表 8:各組中 CK7、Vimentin、IGFBP-1 的 mRNA 表達(dá)水平(n=3, x±s)Tab 8:The mRNA expression of CK7、Vimentin and IGFBP-1 in each group(n=3, x±s)組別 CK7 Vimentin IGFBP-1對照組 1.097 ±0.330 1.324 ±0.232 1.079 ±0.260Transwell 組 3.467 ±0.013 0.564 ±0.125 4.643 ±0.969P 值 0.002 0.045 0.023

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2777327