【摘要】：目的:探索miR-23a抑制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。通過檢測miR-23a在子宮內(nèi)膜樣癌組織、癌旁組織以及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,尋找miR-23a下游靶點(diǎn)及其對(duì)SIX1影響的研究,初步探討miR-23a通過靶向調(diào)控SIX1抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展,為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷及治療提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。方法:第一部分:研究miR-23a在子宮內(nèi)膜樣癌組織、癌旁組織以及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平:1)應(yīng)用qRT-PCR方法檢測16例患者子宮內(nèi)膜樣癌組織、癌旁組織中miR-23a的表達(dá)情況,所有組織標(biāo)本均來自于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科,行手術(shù)切除的病人,收集新鮮未經(jīng)任何干預(yù)治療的子宮內(nèi)膜樣癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。2)培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞、HEC1B細(xì)胞細(xì)胞系,qRT-PCR檢測miR-23a在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平,將miR-23a模擬物或miR-23a ASO轉(zhuǎn)染到Ishikawa細(xì)胞或HEC1B細(xì)胞中,檢測miR-23a表達(dá)水平。3)為了測試miR-23a在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的作用,將miR-23a模擬物或miRNA con轉(zhuǎn)染到Ishikawa細(xì)胞或HEC1B細(xì)胞中,通過細(xì)胞功能試驗(yàn),如克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn),檢測miR-23a對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。第二部分:miR-23a下游靶點(diǎn)SIX1及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究。1)使用microRNA.org、TargetScan、miRanda等軟件尋找miR-23a的靶點(diǎn),在其靶點(diǎn)的列表上發(fā)現(xiàn)了SIX1。為了測試miR-23a和SIX1之間是否存在直接作用,采用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測的方法,在螢火蟲熒光素酶基因下游插入野生型或突變型SIX1 3'UTR。將pGL3-SIX1 UTR WT,pGL3-SIX1 UTR Mut和pGL3構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染到HEC1B細(xì)胞中,給予miR-23a模擬物或miRNA con,檢測熒光素酶活性。2)為了驗(yàn)證miR-23a和SIX1在子宮內(nèi)膜樣癌組織中的關(guān)系,選取30例子宮內(nèi)膜樣癌組織標(biāo)本,IHC的方法檢測SIX1的表達(dá),并且將30個(gè)病例分成2組:SIX1低和高表達(dá)組。qRT-PCR的方法檢測上述兩組中的miR-23a表達(dá)(SIX1低和高表達(dá)組:每組n=15)。分析miR-23a和SIX1在子宮內(nèi)膜樣癌組織中的表達(dá)是否存在相關(guān)性。3)為了研究SIX1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,使用SIX1質(zhì)�；騭iRNA提高或降低HEC1B或Ishikawa細(xì)胞中SIX1的表達(dá),通過細(xì)胞功能試驗(yàn),如克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn),檢測SIX1對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。4)不同miR-23a處理子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系后,Western blot檢測SIX1蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在HEC1B細(xì)胞中,用miR-23a ASO或ASO con處理,檢測SIX1蛋白表達(dá)水平;在Ishikawa細(xì)胞中,用miR-23a模擬物或miRNA con處理,檢測SIX1蛋白表達(dá)水平。第三部分:初步探討miR-23a通過靶向調(diào)控SIX1抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。1)miR-23a敲低或過表達(dá)后,通過同時(shí)添加SIX1 siRNA或質(zhì)粒,來檢測對(duì)細(xì)胞增殖,遷移和侵襲能力的影響。在HEC1B或Ishikawa細(xì)胞中,qRT-PCR檢測在不同處理組中miR-23a表達(dá)水平。Western blot檢測不同處理組中SIX1蛋白表達(dá)的水平。通過細(xì)胞功能試驗(yàn),如克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn),檢測不同處理組對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。2)為了驗(yàn)證miR-23a模擬物和/或紫杉醇Taxol的抑制作用并確定miR-23a是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)SIX1表達(dá),將Ishikawa細(xì)胞裸鼠成瘤。檢測不同處理組腫瘤體積大小。Western blot評(píng)估小鼠腫瘤中的SIX1的表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分:1)與癌旁組織相比,miR-23a表達(dá)水平在子宮內(nèi)膜樣癌組織中平均減少42%(分別為P0.05)。2)miR-23a模擬物或miR-23a ASO轉(zhuǎn)染到Ishikawa細(xì)胞或HEC1B細(xì)胞中,miR-23a的表達(dá)增加或降低(分別為P0.05)。3)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-23a可抑制Ishikawa細(xì)胞和HEC1B細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力(分別為P0.05):克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-23a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力明顯減弱(分別為P0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-23a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,劃痕空間顯著變寬(分別為P0.05);transwell測定的結(jié)果顯示,miR-23a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,侵襲的細(xì)胞顯著減少(分別為P0.05)。第二部分:1)miR-23a顯著降低野生型SIX1 3'UTR相對(duì)的熒光素酶活性(P0.05),但miR-23a不能降低突變型SIX1 3'UTR相對(duì)的熒光素酶活性(P0.05)。結(jié)果表明miR-23a可能直接與SIX1 3'UTR結(jié)合。2)在SIX1低和高表達(dá)組織樣品之間,miR-23a的表達(dá)存在顯著差異(P0.05),表明miR-23a和SIX1在子宮內(nèi)膜樣癌組織中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。3)SIX1質(zhì)粒組或siRNA組處理HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞后,SIX1蛋白的表達(dá)分別增加或減少(分別為P0.05)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SIX1的表達(dá)增加或減少后,HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力增強(qiáng)或減弱�？寺�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SIX1的表達(dá)增加或減少后,HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞增殖能力分別顯著增強(qiáng)或減弱(分別為P0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞中升高或降低SIX1,導(dǎo)致劃痕寬度顯著縮小或增大(分別為P0.05)。transwell結(jié)果顯示:在HEC1B或Ishikawa細(xì)胞中,SIX1表達(dá)增加或減少后,侵襲的細(xì)胞數(shù)目顯著增多或減少(分別為P0.05)。4)在HEC1B細(xì)胞中用miR-23a ASO處理后,SIX1蛋白表達(dá)水平顯著增高(P0.05)。在Ishikawa細(xì)胞中用miR-23a模擬物處理,SIX1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)�？傊�,miR-23a可以下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中SIX1的表達(dá)。第三部分:1)在HEC1B細(xì)胞中,miR-23a ASO組中miR-23a表達(dá)水平降低(P0.05),而SIX1 siRNA+miR-23a ASO組與miR-23a ASO組相比較,miR-23a的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在Ishikawa細(xì)胞中,miR-23a模擬物組中miR-23a表達(dá)水平增加(P0.05),而SIX1質(zhì)粒+miR-23a模擬物組與miR-23a模擬物組相比較,miR-23a的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果證明,當(dāng)miR-23a的敲低或過表達(dá)后,通過添加SIX1 siRNA或質(zhì)粒,miR-23a的表達(dá)沒有減少或增加。但是在miR-23a ASO或miR-23a模擬組中,miR-23a的敲低或過表達(dá)后,SIX1表達(dá)增加或減少(分別為P0.05),同時(shí)在HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞中添加SIX1siRNA或質(zhì)粒,SIX1表達(dá)減少或增加(分別為P0.05)。結(jié)果表明miR-23a靶向調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中SIX1的表達(dá)。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:克隆實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell測定的結(jié)果表明,在HEC1B細(xì)胞或Ishikawa細(xì)胞中,miR-23a ASO或miR-23a模擬組中miR-23a的敲低或過表達(dá)后,細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)或減弱(分別為P0.05),但是當(dāng)miR-23a敲低或過表達(dá)后,可以通過下調(diào)或上調(diào)SIX1的表達(dá)來恢復(fù),從而改變細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(分別為P0.05)。總之,miR-23a可以通過靶向SIX1來抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。2)與MOCK對(duì)照組相比,紫杉醇Taxol組的平均腫瘤體積顯著減小(P0.05)。與模擬物陰性對(duì)照組相比,miR-23a模擬物和miR-23a模擬物+Taxol組的平均腫瘤體積顯著減小(分別為P0.05)。此外,與Taxol組相比,miR-23a+Taxol組的平均腫瘤體積顯著減小(P0.05)。Western blot檢測小鼠腫瘤中的SIX1表達(dá)水平,結(jié)果顯示:miR-23a模擬物組和/或Taxol組,SIX1的表達(dá)水平降低(分別為P0.05)。與Taxol組比較,miR-23a模擬物+Taxol組中SIX1的表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。用miR-23a模擬物和/或Taxol處理的小鼠,其體重沒有顯著差異,所測試的小鼠中沒有因?qū)嶒?yàn)方法出現(xiàn)不良反應(yīng),并且通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)或觀察肝臟以及腎功能,沒有觀察到毒性作用。這些結(jié)果證明了miR-23a模擬物和/或Taxol的抗腫瘤作用和安全性。總之,上述結(jié)果表明miR-23a可通過靶向調(diào)控SIX1抑制體內(nèi)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)miR-23a可能是子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的“抑癌基因”,miR-23a-SIX1相互作用的異常改變可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果表明SIX1被miR-23a靶向調(diào)控,當(dāng)miR-23a敲低或過表達(dá)后,通過在體外添加SIX1siRNA或質(zhì)粒,改變細(xì)胞功能,導(dǎo)致細(xì)胞增殖,遷移,侵襲功能被下調(diào)或上調(diào)。miR-23a可通過靶向調(diào)控SIX1抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。miR-23a可能作為子宮內(nèi)膜癌治療的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33
【圖文】：

17圖 1. 檢測 16 例人組織（子宮內(nèi)膜樣癌和癌旁組織）中 miR-23a 的表達(dá)水平。 A.與配對(duì)的癌旁組織相比，miR-23a 在子宮內(nèi)膜樣癌組織中的表達(dá)水平平均減少 42％。 B.在 HEC1B 細(xì)胞系中 miR-23a 模擬物組與 miRNAcon 對(duì)照組比較，miR-23a 表達(dá)水平增高（P <0.05）。 C.在 Ishikawa 細(xì)胞系中 miR-23a ASO轉(zhuǎn)染組與 ASO con 對(duì)照組比較，miR-23a 表達(dá)水平降低（P <0.05）。

圖 1.miR-23a 的 qRT-PCR 擴(kuò)增曲線（D）及溶解曲線（E）我們可以看出，D 是 miR-23a 的 qRT-PCR 的擴(kuò)增曲線；E 是 miR-23a 的qRT-PCR 溶解曲線圖。1.2.2 miR-23 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力體外實(shí)驗(yàn)檢測 miR-23a 對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-23a 表達(dá)增加可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力（分別為 P <0.05，圖 2A，2B 和 2C）：細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-23a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后增殖能力與對(duì)照組相比明顯減弱（分別為 P <0.05，圖 2A）。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，miR-23a 模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，劃痕空間顯著更寬（分別為 P <0.05，圖 2B）。而且，transwell 測定的結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，miR-23a 模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞顯著減少（分別為 P <0.05，圖2C）�？傊�，這些結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜癌組織中 miR-23a 表達(dá)降低，miR-23 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

體外實(shí)驗(yàn)miR-23a對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 金愛紅;周霞平;周鳳珍;;抑制miR-23a表達(dá)增強(qiáng)卵巢癌順鉑敏感性的分子機(jī)制[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

2 朱龍萍;金麗艷;蔣日月;汪茜茜;蔣健;毛朝明;陳德玉;;食管鱗癌腫瘤微環(huán)境中miRNA與TGF-β1的相關(guān)性分析[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年05期

本文編號(hào)：2762220