本文關(guān)鍵詞：Laminin蛋白對UBM上BMSCs增殖及其向平滑肌細(xì)胞分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)是老年婦女的常見臨床疾病,在老年婦女中的發(fā)病率高達(dá)27.6%,嚴(yán)重影響了廣大婦女生活質(zhì)量[1-3]。SUI的發(fā)病機(jī)制與女性盆底結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān),目前已經(jīng)得到婦產(chǎn)科學(xué)界的重視。手術(shù)治療是SUI的常用治療方法,懸吊術(shù)已成為SUI治療的一線手術(shù)方式[4,5]。目前臨床運(yùn)用的吊帶材料包括合成材料和生物材料[6]。合成材料因其具有組織侵蝕性強(qiáng)、瘢痕形成等難以克服的缺陷,不利于臨床廣泛推廣。而經(jīng)脫細(xì)胞處理的生物材料因保留了組織的完整性,且免疫源性低,已被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)[7],脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)(Urinary bladder matrix,UBM)是生物材料的一種,初步研究表明其在SUI的治療中具有一定的潛能[8],但面臨的最大問題是降解周期短,從而導(dǎo)致SUI復(fù)發(fā)。一些學(xué)者提出將干細(xì)胞種植于生物材料上進(jìn)行替代治療可能是SUI的有效治療手段[9],然而卻存在著負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的UBM存在著BMSCs增殖率低以及向平滑肌細(xì)胞分化程度低的缺點(diǎn)[10],因此,如何提高UBM上BMSCs的增殖率及向平滑肌細(xì)胞分化率是目前亟待解決的熱點(diǎn)問題。已有研究報(bào)道,Laminin蛋白通過其LG端功能域與BMSCs表面的整合素受體相結(jié)合從而促進(jìn)BMSCs的增殖[11],并且有報(bào)道稱將Laminin蛋白加入到培養(yǎng)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中,作為體外擴(kuò)增人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一種常用方法[12]。同時(shí),Laminin蛋白可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等方向分化[13]。而Laminin蛋白不僅是構(gòu)成UBM材料基底層的基本結(jié)構(gòu),而且是UBM基底層最重要的功能蛋白[14]。但是UBM上的Laminin蛋白是否具有促進(jìn)負(fù)載BMSCs增殖及向平滑肌細(xì)胞分化的功能尚不明確。結(jié)合我們的前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過脫細(xì)胞處理后的UBM上Laminin蛋白的LG域在基底層面處于向外的游離狀態(tài),而通過交聯(lián)劑交聯(lián)后可使部分LG域相互融合而喪失功能[15],由此進(jìn)一步證明Laminin蛋白的LG功能域在BMSCs增殖、遷移以及分化中的作用。因此,我們推測ubm上的laminin蛋白也具有促進(jìn)bmscs增殖及向平滑肌細(xì)胞分化的功能,探討ubm上laminin蛋白的這一功能,對現(xiàn)有的ubm進(jìn)行改善,從而為sui新型生物材料的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)方法1.1bmscs的制備采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)3-4周雌性sd大鼠的bmscs,運(yùn)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測bmscs的免疫表型,進(jìn)行干細(xì)胞鑒定,將p3代bmscs作為種子細(xì)胞。1.2ubm的制備采用機(jī)械分離和酶消化等方法對新鮮豬膀胱進(jìn)行處理,達(dá)到脫細(xì)胞目的,進(jìn)行冷凍干燥、消毒滅菌后密封保存,作為組織工程材料。1.3ubm復(fù)合材料的制備采用蛋白孵育法,制備ubm+laminin材料以及ubm+anti-laminin材料,進(jìn)行免疫組化學(xué)檢測laminin蛋白在復(fù)合材料組及單純ubm組的表達(dá)情況。1.4.ldh檢測bmscs活性取p3代bmscs,按3000/孔接種于96孔板,實(shí)驗(yàn)組為ubm+laminin組、ubm組和ubm+anti-laminin材料,每孔加120μl的細(xì)胞培養(yǎng)液,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,置于37℃,5%co2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。分別取培養(yǎng)1d、3d、5d、7d、9d細(xì)胞上清液行l(wèi)dh檢測。1.5ckk8檢測bmscs增殖實(shí)驗(yàn)組分為3組,分別為:ubm+laminin組、ubm組和ubm+anti-laminin組。每組5個(gè)附孔,每孔3000個(gè)bmscs接種于96孔板,于培養(yǎng)1、3、5、7、9、12、14天的組織行cck8檢測。1.6he染色觀察bmscs遷移情況將p3代bmscs(1×105/cm2)接種于三組材料上,定期觀察培養(yǎng)液有無渾濁,于接種3d、5d、7d、14d的組織行he染色,定向觀察bmscs在不同材料上的遷移情況。1.7免疫組化學(xué)技術(shù)檢測bmscs向smc分化情況取接種第14天的組織行免疫學(xué)檢測bmscs表達(dá)α-sma情況,觀察bmscs向平滑肌細(xì)胞分化情況。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1bmscs的分離、培養(yǎng)及鑒定顯微鏡下觀察原代分離的bmscs呈漩渦狀、貼壁生長,雜細(xì)胞較多,培養(yǎng)1周后細(xì)胞融合達(dá)90%。傳代后細(xì)胞較均一,形態(tài)規(guī)則,呈長梭型,增殖快。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測bmscs表達(dá)中胚層來源分子cd29,陽性率為98.0%,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特征分子cd31,陽性率為4.56%,表達(dá)造血干細(xì)胞系特征分子cd34,陽性率為3.30%,符合bmscs的特征。2.2ubm的制備肉眼觀察ubm材料呈致密均勻的半透明的膜狀組織,顯微觀察ubm由致密均勻的膠原纖維和基質(zhì)組成,掃描電鏡觀察ubm的膠原分布致密均勻,纖維完整,未見細(xì)胞殘留。2.3ubm復(fù)合材料的制備免疫組化學(xué)檢測ubm材料表明laminin蛋白主要分布于基底層面,部分位于非基底層,laminin蛋白孵化ubm組laminin蛋白表達(dá)明顯增高,anti-laminin組表達(dá)明顯下降,表明材料上部分蛋白可以被抗體封閉。2.4三組材料負(fù)載bmscs的活性共培養(yǎng)5天,ubm+anti-laminin組ldh檢測值明顯升高,表明死亡細(xì)胞數(shù)目增多。三組材料上bmscs的ldh值均在培養(yǎng)第7天達(dá)高峰,7-9天ldh曲線呈平行趨勢。ubm+anti-laminin組ldh檢測值明顯高于其余兩組,而ubm+laminin與ubm無明顯的差異。2.5三組材料bmscs生長情況運(yùn)用cck8檢測方法表明三組材料均能支持bmscs生長,三組細(xì)胞生長曲線類似,培養(yǎng)1周內(nèi),細(xì)胞處于潛伏適應(yīng)期,培養(yǎng)1周后細(xì)胞呈對數(shù)生長,培養(yǎng)9天后細(xì)胞生長基本到達(dá)平臺(tái),ubm+laminin組對bmscs增殖有顯著促進(jìn)作用。2.6he染色觀察bmscs遷移情況取共培養(yǎng)3、5、7、14天組織行he染色觀察,三組材料均能支持細(xì)胞粘附生長,培養(yǎng)3天發(fā)現(xiàn)ubm+laminin組材料表面有多層細(xì)胞附著,細(xì)胞密度明顯高于其他兩組,隨接種時(shí)間延長,可見細(xì)胞明顯向深層遷移,培養(yǎng)14天,部分細(xì)胞到達(dá)材料基底層,且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞核拉伸延長。ubm組bmscs主要集中在材料表面生長,部分向深層遷移,而ubm+anti-laminin組共培養(yǎng)期間細(xì)胞依舊粘附在材料表面,僅個(gè)別細(xì)胞向深層遷移。2.7免疫組化學(xué)技術(shù)檢測BMSCs向SMC分化情況共培養(yǎng)14天,免疫組化學(xué)檢測BMSCs中平滑肌標(biāo)記性蛋白α-SMA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)UBM+Laminin組表達(dá)強(qiáng)陽性,UBM組呈弱陽性,而UBM+Anti-Laminin組則表達(dá)陰性。結(jié)論1.分離培養(yǎng)了純度較高的BMSCs;2.成功制備了UBM材料;3.構(gòu)建了UBM+Laminin復(fù)合材料以及UBM+Anti-Laminin復(fù)合材料;4.研究表明UBM上的Laminin蛋白具有促進(jìn)負(fù)載BMSCs增殖、遷移以及向平滑肌分化的能力。
【關(guān)鍵詞】：膀胱 豬 脫細(xì)胞基質(zhì) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Laminin 增殖 遷移 分化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R711.59
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備16-21
• 2.1 材料與方法16-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-19
• 2.3 討論19-20
• 2.4 小結(jié)20-21
• 第三章 基質(zhì)材料的制備21-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法21-23
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-28
• 3.3 討論28-29
• 3.4 小結(jié)29-30
• 第四章 Laminin蛋白對UBM上BMSCs增殖及其向平滑肌細(xì)胞分化的影響30-39
• 4.1 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-36
• 4.3 討論36-38
• 4.4 小結(jié)38-39
• 全文總結(jié)39
• 參考文獻(xiàn)39-48
• 文獻(xiàn)綜述 壓力性尿失禁的研究進(jìn)展48-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 碩士期間發(fā)表文章56-57
• 致謝57

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊文增;;血漿Laminin P_1在診斷膀胱移行細(xì)胞癌中的作用[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;1993年01期

2 ;Influence of BOL on hyaluronic acid,laminin and hyperplasia in hepatofibrotic rats[J];World Journal of Gastroenterology;2001年06期

3 胡佳;蘭曉莉;張永學(xué);高再榮;伍軍;;A Comparative Study of ~(99m)Tc-YIGSR and 99mTc-MIBI Uptake in Tumor Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年06期

4 初永麗 ,楊元先 ,林美華 ,王澤華;Detection of Laminin in Serum and Ascites from Patients with Epithelial Ovarian Tumor[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Med;2002年01期

5 李令勛,丁國富;Detection of Serum Hyaluronic Acid and Laminin in Patients with Bladder Tumors[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2003年01期

6 Heitor Rosa;Edison Roberto Parise;;Is there a place for serum laminin determination in patients with liver disease and cancer?[J];World Journal of Gastroenterology;2008年23期

7 Toshikuni Oka;Hiroyuki Yamamoto;Shigeru Sasaki;Masanori Ii;Keiichi Hizaki;Hiroaki Taniguchi;Yasushi Adachi;Kohzoh Imai;Yasuhisa Shinomura;;Overexpression of β3/γ2 chains of laminin-5 and MMP7 in biliary cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2009年31期

8 秦天潔;孫紅;王康敏;黃鶯;;CD44v6,laminin在食管癌中的表達(dá)及分析[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年21期

9 徐慧君;武義鳴;馮家笙;;Laminin在大白鼠胚腦的分布[J];南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);1990年01期

10 張桂梅,馮作化,張慧,李東,范曲;Comparative Study on the Inhibitory Effect of RecombinantFN Polypeptide CH50 and CH56 on the Metastasis ofMelanoma Cells[J];Journal of Tongji Medical University;1997年03期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 She-Juan An;Zhi-Hong Chen;Wei Meng;Zhi Xie;Hong-hong Yan;Jian Su;Ying Huang;Shi-Liang Chen;Yi-Long Wu;;-183G>A polymorphism of laminin 5 regulate the transcriptional level of the gene in patients with non-small cell lung cancer[A];第13屆全國肺癌學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2013年

2 薛麗燕;宋詠梅;鄒霜梅;謝永強(qiáng);董麗佳;溫們;劉秀云;童彤;詹啟敏;呂寧;;laminin-5γ2和SPARC在食管鱗癌中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆全國病理大會(huì)論文匯編[C];2007年

3 ;Micro/nanoscale tools for neurobiology[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

4 ;α6β1 on Bel-7402 cell laminin interaction studied by atomic force microscopy[A];第八屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

5 馮銳成;張振武;梁杰;梁洋;滕春波;;Laminin和Fibronectin對胰腺祖細(xì)胞增殖分化的調(diào)控研究[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2013年全國學(xué)術(shù)大會(huì)·武漢論文摘要集[C];2013年

6 ;Betal integrin links laminin-mediated adhesion to microtubule assembly during neuronal polarization[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

7 ;Stat3 signaling target Efemp2 controls the assembly of Fibronectin and Laminin for gastrula anterior cell migration[A];2012全國發(fā)育生物學(xué)大會(huì)摘要集[C];2012年

8 唐圓;劉丹;姚理;郭東華;;非成髓鞘雪旺細(xì)胞中l(wèi)aminin對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的作用[A];中國解剖學(xué)會(huì)2013年年會(huì)論文文摘匯編[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 曲惠廷;間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的調(diào)控及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];山東大學(xué);2014年

2 韓巖;Laminin和Ⅰ、Ⅳ型膠原對神經(jīng)軸突生長作用的相關(guān)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1995年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 魏桂枝;Laminin蛋白對UBM上BMSCs增殖及其向平滑肌細(xì)胞分化的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 趙利;巨噬細(xì)胞與表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對RSC96細(xì)胞表達(dá)NGF和Laminin的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

3 裴燕;Dyrk1B、IKKε、Lamininγ1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年

4 楊娜;p63、Ki-67及Laminin在淚腺上皮性腫瘤的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：Laminin蛋白對UBM上BMSCs增殖及其向平滑肌細(xì)胞分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：275814