發(fā)布時間：2017-03-27 15:06

  本文關(guān)鍵詞：補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細胞中ACTA及其Smads信號通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:前期研究證實,補腎法、疏肝法具有提高體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)患者臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局、提高卵母細胞質(zhì)量的作用,本研究擬通過觀察補腎法、疏肝法對IVF-ET患者體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細胞ACTA及其信號通路的調(diào)控作用,以探討兩法促進卵泡發(fā)育、提高卵母細胞質(zhì)量作用機制及其途經(jīng)的異同。方法:1含藥血清制備補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方含藥血清:選取年齡在20-30歲,身體健康,月經(jīng)規(guī)律,B超顯示有成熟卵泡,且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者10名,分別服用補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方。補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方服用方法是每日1劑,300ml,早晚分服。補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方連續(xù)服藥3天,第4天清晨空腹服用全天劑量藥物(服藥前禁食12h),于末次服藥1h后靜脈取血5ml,室溫靜置2h,3000r/min離心10min,取上清,56℃水浴30 min滅活補體,0.22μm無菌濾器過濾除菌、分裝制備補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方兩種人含藥血清。正常血清:選取年齡在20-30歲,身體健康,月經(jīng)規(guī)律,B超顯示有成熟卵泡,且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者5名,清晨空腹靜脈采血5ml,同上制備正常人血清,設(shè)為正常血清對照。以上血清均-20℃保存?zhèn)溆谩?卵巢壁顆粒細胞培養(yǎng)將含有顆粒細胞的卵泡液經(jīng)梯度離心后獲得壁顆粒細胞,于35mm培養(yǎng)皿中置2ml培養(yǎng)液,37℃、5%CO2(V/V)、100%濕度培養(yǎng),24h后細胞貼壁。分別加入補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸含藥血清,分為補腎組和疏肝組,補腎含藥血清組與疏肝含藥血清組分別設(shè)置低、中、高三個劑量組,正常血清為正常組,不加血清為空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集顆粒細胞。第一批采用機械方法收集顆粒細胞,置于-80℃保存?zhèn)溆?用于實時熒光定量PCR)。第二批采用機械與酶結(jié)合的方法,迅速放入2%多聚甲醛中固定(分別用于免疫組化和免疫熒光)。補腎高劑量組與疏肝高劑量組在中藥孵育24h后,加入SB431542(濃度為10μmol/L),繼續(xù)孵育2h,分別為補腎阻斷劑組和疏肝阻斷劑組,收集與實驗方法同上。采用實時熒光定量PCR檢測ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表達;采用免疫組化法、免疫熒光法檢測顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4以及P-Smad2、P-Smad3蛋白的表達。結(jié)果:1體外培養(yǎng)各組卵巢壁顆粒細胞ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表達1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達比較正常組較空白組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達升高(P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達均升高(均P0.05);且疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達高于疏肝中劑量組及疏肝低劑量組(均P0.05);疏肝中劑量組表達高于疏肝低劑量組(P0.05),呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補腎低、中、高劑量組的顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達升高(均P0.05);且補腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達較補腎中、低劑量組均升高(均P0.05),呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較,補腎高劑量組顆粒細胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA的表達最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其余各組表達由高至低依次是補腎中劑量組、疏肝高劑量組、疏肝中劑量組、補腎低劑量組、疏肝低劑量組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。1.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達下降(均P0.05)。與補腎阻斷劑組比較,補腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表達明顯升高(均P0.05);補腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達無差異(P0.05);空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表達下降(均P0.05)。2各組之間體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達2.1免疫組化結(jié)果2.1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達比較正常組與空白組之間比較,正常組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達均高于空白組(均P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達升高(均P0.05);且疏肝高劑量組蛋白表達最高,其次為疏肝中、低劑量組,呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補腎低、中、高劑量組的顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達升高(均P0.05);且補腎高劑量組蛋白表達最高,其次為補腎中劑量組和補腎低劑量組,呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較,補腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),補腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達均升高(P0.05),補腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.1.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達下降(均P0.05)。與補腎阻斷劑組比較,補腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達明顯升高(均P0.05);補腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達無差異(P0.05);空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達下降(均P0.05)。2.2細胞免疫熒光結(jié)果2.2.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達比較正常組與空白組之間比較,正常組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達均高于空白組(均P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達升高(均P0.05);且疏肝高劑量組蛋白表達最高,其次為疏肝中、低劑量組,呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補腎低、中、高劑量組的顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達升高(均P0.05);且補腎高劑量組蛋白表達最高,其次為補腎中劑量組和補腎低劑量組,呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較,補腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達升高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),補腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達均升高(P0.05),補腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.2.2疏肝、補腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達下降(均P0.05)。與補腎阻斷劑組比較,補腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達明顯升高(均P0.05);補腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達無差異(P0.05);空白組、正常組與補腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達下降(均P0.05)。結(jié)論:1逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可以提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及蛋白的表達,增強ACTA促進卵泡生長發(fā)育、提高卵母細胞質(zhì)量的作用。2逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方影響ACTA信號通路的作用呈劑量依賴性,即高劑量效果最優(yōu)。3補腎調(diào)經(jīng)方含藥血清在提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及其蛋白的表達作用比逍遙散方更顯著,提示補腎調(diào)經(jīng)方促進卵泡生長發(fā)育、提高卵母細胞質(zhì)量優(yōu)于逍遙散方。4逍遙散方和補腎調(diào)經(jīng)方可通過上調(diào)ACTA及其Smads信號通路來發(fā)揮其促進卵泡生長發(fā)育和提高卵母細胞質(zhì)量的作用,其機制可能是誘導(dǎo)ACTA與其Ⅱ型受體ACTRⅡB形成復(fù)合物,進而募集Ⅰ型受體ALK4,使其發(fā)生磷酸化而活化,進一步磷酸化細胞內(nèi)的信號因子Smad2、Smad3、Smad4,進而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：逍遙散方 補調(diào)經(jīng)方 ACTA ACTRⅡB ALK4 Smad2 Smad3 Smad4
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-16
• 英文縮寫16-17
• 前言17-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-47
• 附表47-53
• 討論53-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-65
• 綜述 ACTA在生殖醫(yī)學(xué)中的研究進展65-75
• 參考文獻72-75
• 致謝75-76
• 個人簡歷76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陶金紅;董莉;;補腎活血方對腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征激活素-抑制素-卵泡抑素系統(tǒng)的影響[J];上海中醫(yī)藥雜志;2014年07期

2 沈浣;;顆粒細胞與卵母細胞發(fā)育[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2012年05期

3 鄭娟;侯振;祁曉晨;冒韻東;崔毓桂;劉嘉茵;;激活素A對子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的調(diào)節(jié)作用[J];生殖與避孕;2012年05期

4 辛明蔚;梁欣韞;何軍琴;李瑪建;王玉雯;高愛萍;張瑩;楊維;武穎;;溫腎養(yǎng)血顆粒聯(lián)合枸櫞酸氯米芬對卵泡發(fā)育不良性不孕癥抑制素—激活素—卵泡抑素系統(tǒng)的調(diào)控[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2011年12期

5 羅亞萍;馬惠榮;杜惠蘭;李湘;李青;;逍遙丸對雄激素致無排卵大鼠卵巢功能的影響[J];河北中醫(yī)藥學(xué)報;2009年03期

6 韓延華;劉淑君;王春梅;;韓百靈治療肝郁不孕學(xué)術(shù)經(jīng)驗概要[J];遼寧中醫(yī)雜志;2006年08期

7 連方;滕依麗;張建偉;孫振高;劉延荷;穆琳;王琳;張寧;孟茜;;二至天癸顆粒聯(lián)合體外受精-胚胎移植治療不孕癥61例臨床研究[J];中醫(yī)雜志;2006年06期

8 李燦東,林雪娟,蘭啟防,黃熙理,高碧珍,丁杰;不孕癥肝郁病理的生殖內(nèi)分泌實質(zhì)研究[J];河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年06期

9 殷燕云;夏桂成教授治療月經(jīng)病經(jīng)驗[J];四川中醫(yī);2004年12期

10 李燦東,林雪娟,高碧珍,蘭啟防,黃熙理,丁杰;不孕癥肝郁病理及證候兼雜規(guī)律的臨床研究[J];福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2004年06期

  本文關(guān)鍵詞：補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細胞中ACTA及其Smads信號通路的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270567