本文關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA及其Smads信號(hào)通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:前期研究證實(shí),補(bǔ)腎法、疏肝法具有提高體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)患者臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用,本研究擬通過觀察補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)IVF-ET患者體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細(xì)胞ACTA及其信號(hào)通路的調(diào)控作用,以探討兩法促進(jìn)卵泡發(fā)育、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量作用機(jī)制及其途經(jīng)的異同。方法:1含藥血清制備補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方含藥血清:選取年齡在20-30歲,身體健康,月經(jīng)規(guī)律,B超顯示有成熟卵泡,且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者10名,分別服用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方服用方法是每日1劑,300ml,早晚分服。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙散方連續(xù)服藥3天,第4天清晨空腹服用全天劑量藥物(服藥前禁食12h),于末次服藥1h后靜脈取血5ml,室溫靜置2h,3000r/min離心10min,取上清,56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體,0.22μm無菌濾器過濾除菌、分裝制備補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散方兩種人含藥血清。正常血清:選取年齡在20-30歲,身體健康,月經(jīng)規(guī)律,B超顯示有成熟卵泡,且無卵巢、子宮器質(zhì)性疾病的女性志愿者5名,清晨空腹靜脈采血5ml,同上制備正常人血清,設(shè)為正常血清對(duì)照。以上血清均-20℃保存?zhèn)溆谩?卵巢壁顆粒細(xì)胞培養(yǎng)將含有顆粒細(xì)胞的卵泡液經(jīng)梯度離心后獲得壁顆粒細(xì)胞,于35mm培養(yǎng)皿中置2ml培養(yǎng)液,37℃、5%CO2(V/V)、100%濕度培養(yǎng),24h后細(xì)胞貼壁。分別加入補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸含藥血清,分為補(bǔ)腎組和疏肝組,補(bǔ)腎含藥血清組與疏肝含藥血清組分別設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量組,正常血清為正常組,不加血清為空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集顆粒細(xì)胞。第一批采用機(jī)械方法收集顆粒細(xì)胞,置于-80℃保存?zhèn)溆?用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR)。第二批采用機(jī)械與酶結(jié)合的方法,迅速放入2%多聚甲醛中固定(分別用于免疫組化和免疫熒光)。補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組在中藥孵育24h后,加入SB431542(濃度為10μmol/L),繼續(xù)孵育2h,分別為補(bǔ)腎阻斷劑組和疏肝阻斷劑組,收集與實(shí)驗(yàn)方法同上。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表達(dá);采用免疫組化法、免疫熒光法檢測(cè)顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4以及P-Smad2、P-Smad3蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1體外培養(yǎng)各組卵巢壁顆粒細(xì)胞ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA的表達(dá)1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)比較正常組較空白組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)升高(P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)均升高(均P0.05);且疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)高于疏肝中劑量組及疏肝低劑量組(均P0.05);疏肝中劑量組表達(dá)高于疏肝低劑量組(P0.05),呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補(bǔ)腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)升高(均P0.05);且補(bǔ)腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)較補(bǔ)腎中、低劑量組均升高(均P0.05),呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補(bǔ)腎低、中、高劑量組之間比較,補(bǔ)腎高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA的表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組表達(dá)由高至低依次是補(bǔ)腎中劑量組、疏肝高劑量組、疏肝中劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝低劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。1.2疏肝、補(bǔ)腎阻斷劑組與非阻斷劑組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)下降(均P0.05)。與補(bǔ)腎阻斷劑組比較,補(bǔ)腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表達(dá)明顯升高(均P0.05);補(bǔ)腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與補(bǔ)腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、Smad4m RNA表達(dá)下降(均P0.05)。2各組之間體外培養(yǎng)卵巢壁顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)2.1免疫組化結(jié)果2.1.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較正常組與空白組之間比較,正常組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均高于空白組(均P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高(均P0.05);且疏肝高劑量組蛋白表達(dá)最高,其次為疏肝中、低劑量組,呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補(bǔ)腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高(均P0.05);且補(bǔ)腎高劑量組蛋白表達(dá)最高,其次為補(bǔ)腎中劑量組和補(bǔ)腎低劑量組,呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補(bǔ)腎低、中、高劑量組之間比較,補(bǔ)腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),補(bǔ)腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達(dá)均升高(P0.05),補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.1.2疏肝、補(bǔ)腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P0.05)。與補(bǔ)腎阻斷劑組比較,補(bǔ)腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P0.05);補(bǔ)腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與補(bǔ)腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P0.05)。2.2細(xì)胞免疫熒光結(jié)果2.2.1正常組、空白組以及各治療組之間顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較正常組與空白組之間比較,正常組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均高于空白組(均P0.05)。與空白組、正常組比較,疏肝低、中、高劑量組顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高(均P0.05);且疏肝高劑量組蛋白表達(dá)最高,其次為疏肝中、低劑量組,呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較,補(bǔ)腎低、中、高劑量組的顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高(均P0.05);且補(bǔ)腎高劑量組蛋白表達(dá)最高,其次為補(bǔ)腎中劑量組和補(bǔ)腎低劑量組,呈劑量依賴性。疏肝低、中、高劑量組與補(bǔ)腎低、中、高劑量組之間比較,補(bǔ)腎高劑量組較疏肝高劑量組ACTA、ACTRⅡB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),補(bǔ)腎中劑量組較疏肝中劑量組蛋白表達(dá)均升高(P0.05),補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2.2疏肝、補(bǔ)腎阻斷劑組與非阻斷劑各組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)比較與疏肝阻斷劑組比較,疏肝高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P0.05);疏肝中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與疏肝低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、P-Smad2、P-Smad3、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P0.05)。與補(bǔ)腎阻斷劑組比較,補(bǔ)腎高劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)明顯升高(均P0.05);補(bǔ)腎中劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)無差異(P0.05);空白組、正常組與補(bǔ)腎低劑量組ACTA、ACTRIIB、ALK4、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、Smad4蛋白表達(dá)下降(均P0.05)。結(jié)論:1逍遙散方和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可以提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及蛋白的表達(dá),增強(qiáng)ACTA促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用。2逍遙散方和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方影響ACTA信號(hào)通路的作用呈劑量依賴性,即高劑量效果最優(yōu)。3補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清在提高體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA、ACTRIIB、ALK4 m RNA及其蛋白的表達(dá)作用比逍遙散方更顯著,提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量?jī)?yōu)于逍遙散方。4逍遙散方和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過上調(diào)ACTA及其Smads信號(hào)通路來發(fā)揮其促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用,其機(jī)制可能是誘導(dǎo)ACTA與其Ⅱ型受體ACTRⅡB形成復(fù)合物,進(jìn)而募集Ⅰ型受體ALK4,使其發(fā)生磷酸化而活化,進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)因子Smad2、Smad3、Smad4,進(jìn)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：逍遙散方 補(bǔ)調(diào)經(jīng)方 ACTA ACTRⅡB ALK4 Smad2 Smad3 Smad4
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-16
• 英文縮寫16-17
• 前言17-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-47
• 附表47-53
• 討論53-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 綜述 ACTA在生殖醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展65-75
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA及其Smads信號(hào)通路的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：270567