【摘要】：隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛開展,卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)越來越受到關(guān)注,玻璃化冷凍成為卵母細(xì)胞冷凍保存的主要技術(shù)之一。而經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后如何獲得更高的移植率和臨床受精率成為許多生殖中心關(guān)注的焦點(diǎn)。玻璃化冷凍的損傷尤其是對超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷成為各實驗室研究的重點(diǎn),它也成為卵母細(xì)胞冷凍成敗的關(guān)鍵。近年來,許多科研中心相繼研究了玻璃化冷凍對動物卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷如微管、紡錘體結(jié)構(gòu)和發(fā)育潛能、皮質(zhì)顆粒、線粒體、胞內(nèi)膜電位等。而關(guān)于人類卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的實驗研究相對缺乏。鑒于此,本研究主要討論了玻璃化冷凍對體外成熟卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)—微絲的影響,對比分析了冷凍前后卵母細(xì)胞微絲分布的變化；同時按照冷凍后不同的復(fù)蘇時間對各組卵母細(xì)胞微絲形態(tài)的恢復(fù)情況進(jìn)行了比較分析,選出最佳的復(fù)蘇時間并在最佳時間內(nèi)對玻璃化冷凍前后的卵母細(xì)胞行胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI),進(jìn)一步分析了玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。 第一部分玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細(xì)胞微絲分布的影響 [目的]通過對體外成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后不同復(fù)蘇時間和新鮮卵母細(xì)胞的染色分析,發(fā)現(xiàn)冷凍對微絲分布的影響及復(fù)蘇的最佳時間。 [方法]收集未成熟卵母細(xì)胞(GV/MI),經(jīng)過體外培養(yǎng)為成熟卵母細(xì)胞,隨機(jī)分為新鮮組和玻璃化冷凍組,玻璃化冷凍組按不同的復(fù)蘇時間再次隨機(jī)分為復(fù)蘇后1h,2h,3h,4h組。所有卵母細(xì)胞用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽行微絲染色,之后用激光共聚焦顯微鏡(LSM780)觀察。 [結(jié)果]經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞成活率為87.37%。新鮮組卵母細(xì)胞微絲分布的正常率為71.11%,復(fù)蘇1h、2h、3h、4h后卵母細(xì)胞微絲分布正常率分別為34.15%、44.18%、69.05%、65.79%。與新鮮組相比,復(fù)蘇后1h、2h均具有顯著性差異(P0.01,P=0.02),復(fù)蘇后3h、4h均無顯著性差異(P=1.00,P=0.64),1h、2h之間與3h、4h之間相比均無顯著性差異(P=0.35,P=0.81)。 [結(jié)論]玻璃化冷凍復(fù)蘇過程改變了人體外成熟卵母細(xì)胞的微絲分布,但是經(jīng)過恰當(dāng)?shù)膹?fù)蘇時間后微絲分布可恢復(fù)至新鮮狀態(tài),繼續(xù)增加復(fù)蘇時間并不會增加卵母細(xì)胞微絲分布的正常率。說明合適的冷凍復(fù)蘇(約3h以上)并未改變體外成熟卵母細(xì)胞的微絲分布。 第二部分玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響 [目的]通過對比分析體外成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍前后發(fā)育潛能的變化,結(jié)合第一部分?jǐn)M從超微結(jié)構(gòu)方面尋找玻璃化冷凍對人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能影響的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。 [方法]收集人未成熟(GV/M I)卵母細(xì)胞,經(jīng)體外成熟為MⅡ期卵母細(xì)胞。將獲得的MⅡ期卵母細(xì)胞按隨機(jī)化原則分組,分為新鮮組和玻璃化冷凍組。將所有卵母細(xì)胞均行卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射,觀察體外成熟卵母細(xì)胞的受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及囊胚形成數(shù)。 [結(jié)果]新鮮組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率分別為73.08%、23.08%、19.23%、6.73%,玻璃化冷凍組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率分別為55.16%、6.74%、9.00%、2.25%。兩組之間的2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率均有顯著性差異(P=0.01,P0.01,P=0.04)；優(yōu)質(zhì)囊胚率二者之間無顯著性差異(P=0.26)。 [結(jié)論]玻璃化冷凍影響了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能,冷凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能大大降低。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2582840