【摘要】：卵巢癌是女性常見(jiàn)腫瘤，位居女性腫瘤發(fā)病率第五位和婦科腫瘤致死率第一位。手術(shù)和基于鉑類(lèi)藥物的聯(lián)合化療是其常規(guī)治療手段，但是因其近70%復(fù)發(fā)和耐藥的形成，致使其五年期生存率不高于40%。所以對(duì)卵巢癌耐藥機(jī)制的深入研究尤為必要。 研究顯示，卵巢癌耐藥的產(chǎn)生與抗凋亡的Bcl-1家族成員（如Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL等）高表達(dá)緊密相關(guān)，這使得抗凋亡和促凋亡相之間的平衡發(fā)生傾斜，促使細(xì)胞逃逸凋亡而產(chǎn)生耐藥。近年來(lái)將靶向于Bcl-2家族抗凋亡蛋白的特異性抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療，相關(guān)基礎(chǔ)研究不斷增加�，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)了一系列模擬促凋亡成員BH3結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑（如ABT-737/263、Obatoclax和AT-101等）。新型BH3模擬物S1能夠同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL，并具有較高的親合力。已有報(bào)道顯示S1能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、白血病細(xì)胞K562、肝癌細(xì)胞SMMC-7721、肺癌細(xì)胞SCLC、卵巢癌細(xì)胞SKOV3和SKOV3/DDP等多種腫瘤細(xì)胞系發(fā)生凋亡。 本研究室已有研究顯示S1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞中，經(jīng)由線(xiàn)粒體途徑介導(dǎo)了凋亡的發(fā)生，同時(shí)也發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑誘導(dǎo)的凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白Caspase-4信號(hào)級(jí)聯(lián)及(c-Jun N-terminalkinase, JNK)途徑被激活。ERS觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded ProteinResponse，UPR）既可能作為適應(yīng)性途徑緩解細(xì)胞所面臨的應(yīng)激狀態(tài)，也可能因嚴(yán)重應(yīng)激而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前認(rèn)為，UPR信號(hào)途徑可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而發(fā)揮抵抗凋亡的效應(yīng)，而B(niǎo)cl-2家族蛋白與UPR、自噬和凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2的BH3模擬物則通過(guò)直接或間接影響這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而決定細(xì)胞的命運(yùn)。研究結(jié)果顯示UPR信號(hào)途徑的主要通路之一(inositol-requiring kinase1, IRE1)可激活JNK，JNK既能激活凋亡信號(hào)，又能介導(dǎo)自噬的活化，還能夠調(diào)節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的決定至關(guān)重要。然而，已有研究多采用JNK廣譜抑制劑，無(wú)法區(qū)別與驗(yàn)證JNK亞型的作用，最近發(fā)現(xiàn)的新的特異性抑制劑等為研究JNK亞型的功能提供了可能。 本研究中，我們采用BH3模擬物S1處理人卵巢癌耐藥細(xì)胞，以高通量方式對(duì)UPR信號(hào)通路相關(guān)84個(gè)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)JNK3持續(xù)高表達(dá)，并通過(guò)應(yīng)用特異性抑制劑Ⅻ和siRNA對(duì)JNK3表達(dá)在人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP中的作用及機(jī)制進(jìn)行了探討。 方法 (1) MTT法檢測(cè)BH3模擬物S1處置卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP存活率。 (2) S1處置卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP，采用PCR array法檢測(cè)UPR信號(hào)通路84種基因變化，篩選差異表達(dá)基因；qPCR確認(rèn)JNK1、JNK2和JNK3表達(dá)基因變化；Western Blot分析JNK3蛋白表達(dá)變化。 (3)根據(jù)JNK3的基因序列（GenBank：NM_002753）以及RNAi設(shè)計(jì)原理，構(gòu)建三條寡核苷酸序列沉默其表達(dá)，命名為Si1，Si2和Si3，并通過(guò)熒光標(biāo)簽、RT-PCR、Western blot等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選有效沉默序列。 (4)利用JNK3特異性抑制劑Ⅻ和siRNA進(jìn)行干預(yù)，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；TUNEL染色法檢測(cè)凋亡變化。 (5)利用JNK3特異性抑制劑Ⅻ和siRNA進(jìn)行干預(yù)，Western blot分析Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)；Western blot分析JNK下游信號(hào)分子c-Jun、p-c-Jun、p53、Noxa和Bax蛋白表達(dá)變化；JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電勢(shì)的變化；同時(shí)，Western blot分析細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Grp78和CHOP的表達(dá)。 (6) DCFH-DA染色觀察人卵巢癌耐藥細(xì)胞ROS水平；抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后合用S1和抑制劑Ⅻ，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。 (7) AO及Lyso-Tracker Red染色檢測(cè)胞內(nèi)酸性結(jié)構(gòu)累積情況；Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達(dá)；自噬抑制劑氯喹與S1合用檢測(cè)存活率。 結(jié)果 1. MTT檢測(cè)顯示，S1能夠劑量依賴(lài)性及時(shí)間依賴(lài)性降低卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的存活率。 2. PCR array法檢測(cè)結(jié)果顯示，在短時(shí)間點(diǎn)（3h）UPR信號(hào)通路多種未折疊蛋白伴侶分子（包括PERK、ATF6和IRE1三條應(yīng)答途徑）表達(dá)上調(diào)應(yīng)答了應(yīng)激，長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)（24h）則呈下降趨勢(shì)，表明ERS趨緩，而JNK3則持續(xù)高表達(dá)，同時(shí)JNK家族其他亞型無(wú)明顯變化。Western blot檢測(cè)也顯示JNK3蛋白水平表達(dá)上調(diào)。 3.結(jié)合mRNA及Western blot檢測(cè)確認(rèn)Si3為JNK3有效沉默序列。 4.較之S1處理，抑制劑Ⅻ和siRNA干預(yù)后，光鏡下皺縮細(xì)胞增多；細(xì)胞存活率顯著降低；抑制劑Ⅻ與S1聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞凋亡率增加。 5.較之S1處理，抑制劑Ⅻ或siRNA與S1合并干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)降低，同時(shí)Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)增加；JNK靶標(biāo)分子c-Jun、p-c-Jun表達(dá)明顯下降；而c-Jun的負(fù)性調(diào)節(jié)靶標(biāo)p53表達(dá)上調(diào)，相應(yīng)地，p53下游分子Noxa和Bax表達(dá)亦明顯上調(diào)；線(xiàn)粒體膜電位顯著下降；未折疊蛋白反應(yīng)伴侶分子Grp78表達(dá)降低、CHOP表達(dá)升高。 6.抑制劑Ⅻ與S1聯(lián)合應(yīng)用后，胞內(nèi)ROS水平顯著增加，氧化損傷導(dǎo)致的存活率降低可被抗氧劑NAC所逆轉(zhuǎn)。 7. AO及Lyso-Tranker Red染色結(jié)果顯示抑制劑Ⅻ與S1聯(lián)合應(yīng)用后胞內(nèi)酸性結(jié)構(gòu)明顯增多；同時(shí)LC3-Ⅱ表達(dá)在S1組、S1合并Ⅻ處理組均顯著增加，p62表達(dá)在合并處理組顯著增加，相應(yīng)地siRNA干預(yù)后也呈現(xiàn)出LC3-Ⅱ和p62表達(dá)升高的趨勢(shì)；氯喹合并S1處理SKOV3/DDP細(xì)胞進(jìn)一步降低了存活率。 結(jié)論 1. BH3模擬物S1能夠降低卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP存活率；UPR相關(guān)基因JNK3的高表達(dá)可能與SKOV3/DDP對(duì)BH3模擬物S1的敏感性密切相關(guān)。 2.抑制JNK3可通過(guò)阻斷其下游靶蛋白c-Jun的活化，誘導(dǎo)p53表達(dá)增加，，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Noxa和Bax的表達(dá)，從而加劇S1誘導(dǎo)卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP凋亡。 3.抑制JNK3通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞氧化損傷從而提高了卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP對(duì)BH3模擬物S1的敏感性。 4.抑制JNK3通過(guò)阻斷細(xì)胞自噬通量從而提高了卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP對(duì)BH3模擬物S1的敏感性。 本文首次探討了JNK家族的亞型JNK3在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用，JNK3可能通過(guò)減少氧化損傷和激活自噬途徑發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。因此JNK3可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的一個(gè)潛在靶標(biāo)。
【圖文】：

圖 1.1 Bcl-2家族蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑[30]第二種模式（間接活化模式）表明Bak不與任何BH3-only蛋白結(jié)合，并且Bax和Bak在未與公認(rèn)的BH3-only活化因子（Bim，Bid）結(jié)合的情況下，甚至是缺乏Bim或Bid、Puma減少的情況下仍可以誘導(dǎo)凋亡[31]。雖然現(xiàn)在還需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控機(jī)制，充分理解Bcl-2的生物途徑，但是靶向Bcl-2家族蛋白的藥物已經(jīng)進(jìn)入腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)。不同于大部分促進(jìn)增殖的致癌基因，Bcl-2通過(guò)抵抗程序性細(xì)胞死亡來(lái)發(fā)揮其功能[32]。由于Bcl-2家族抗凋亡蛋白通過(guò)抵抗凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活，并且在癌細(xì)胞中抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白可以誘導(dǎo)顯著的凋亡現(xiàn)象[33]，這就為我們提供了治療靶點(diǎn)。因?yàn)樵?5%的濾泡性淋巴瘤和20%的彌散性B細(xì)胞淋巴瘤中存在特異性的Bcl-2染色體異位t（14,18），這就導(dǎo)致了Bcl-2基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平失調(diào)[34]。最初對(duì)Bcl-2生物效應(yīng)的體內(nèi)研究是在Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行的，可以發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中Bcl-2的過(guò)表達(dá)集中于B和T淋巴細(xì)胞中，導(dǎo)致了濾泡增殖或者T細(xì)胞

淋巴瘤[35]。圖1.2 直接活化和間接活化模式示意圖[36]通常，高水平的Bcl-2和Bcl-XL與惡性表型和多種惡性血液病以及實(shí)體瘤的化療藥物的耐藥密切相關(guān)[37]。譬如，前列腺癌中高水平Bcl-2與高Gleason分級(jí)以及前列腺切除術(shù)后高復(fù)發(fā)比率相關(guān)[38]。NCI60細(xì)胞系Bcl-XL的表達(dá)與多種化療藥物的耐藥密切相關(guān)，有關(guān)卵巢癌A2780及SKOV3細(xì)胞系的研究也得出相同結(jié)論[39-41]。研究發(fā)現(xiàn)在急性髓細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病中Bcl-2在RNA水平和/或蛋白水平是過(guò)表達(dá)的[42, 43]，而B(niǎo)cl-2/Bax的比率與急性髓細(xì)胞性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病的預(yù)后成負(fù)相關(guān)[44]。盡管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明調(diào)控Bcl-2可以增加癌癥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但是Bcl-2的表達(dá)水平并不影響急性淋巴細(xì)胞性白血病的無(wú)事件生存率和腫瘤轉(zhuǎn)移[45]，這可能是由于Bcl-2家族成員間存在復(fù)雜的交互作用。因此，我們推測(cè)，Bcl-2家族是通過(guò)調(diào)節(jié)促凋亡、抗凋亡蛋白間的平衡來(lái)調(diào)控癌癥細(xì)胞死亡
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊念念;嚴(yán)亞瓊;龔潔;張思維;鄭榮壽;陳萬(wàn)青;;中國(guó)2003～2007年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J];中國(guó)腫瘤;2012年06期

本文編號(hào)：2564250