【摘要】：卵巢癌是女性常見腫瘤，位居女性腫瘤發(fā)病率第五位和婦科腫瘤致死率第一位。手術和基于鉑類藥物的聯合化療是其常規(guī)治療手段，但是因其近70%復發(fā)和耐藥的形成，致使其五年期生存率不高于40%。所以對卵巢癌耐藥機制的深入研究尤為必要。 研究顯示，卵巢癌耐藥的產生與抗凋亡的Bcl-1家族成員（如Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL等）高表達緊密相關，這使得抗凋亡和促凋亡相之間的平衡發(fā)生傾斜，促使細胞逃逸凋亡而產生耐藥。近年來將靶向于Bcl-2家族抗凋亡蛋白的特異性抑制劑應用于腫瘤治療，相關基礎研究不斷增加。現已開發(fā)了一系列模擬促凋亡成員BH3結構域的小分子抑制劑（如ABT-737/263、Obatoclax和AT-101等）。新型BH3模擬物S1能夠同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL，并具有較高的親合力。已有報道顯示S1能夠誘導膠質瘤細胞U251、白血病細胞K562、肝癌細胞SMMC-7721、肺癌細胞SCLC、卵巢癌細胞SKOV3和SKOV3/DDP等多種腫瘤細胞系發(fā)生凋亡。 本研究室已有研究顯示S1在膠質瘤細胞及卵巢癌細胞中，經由線粒體途徑介導了凋亡的發(fā)生，同時也發(fā)生了內質網應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑誘導的凋亡，內質網凋亡蛋白Caspase-4信號級聯及(c-Jun N-terminalkinase, JNK)途徑被激活。ERS觸發(fā)的未折疊蛋白反應（Unfolded ProteinResponse，UPR）既可能作為適應性途徑緩解細胞所面臨的應激狀態(tài)，也可能因嚴重應激而促使細胞發(fā)生凋亡。目前認為，UPR信號途徑可以誘導細胞自噬而發(fā)揮抵抗凋亡的效應，而Bcl-2家族蛋白與UPR、自噬和凋亡等信號轉導途徑密切相關。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2的BH3模擬物則通過直接或間接影響這些信號轉導途徑而決定細胞的命運。研究結果顯示UPR信號途徑的主要通路之一(inositol-requiring kinase1, IRE1)可激活JNK，JNK既能激活凋亡信號，又能介導自噬的活化，還能夠調節(jié)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，對細胞命運的決定至關重要。然而，已有研究多采用JNK廣譜抑制劑，無法區(qū)別與驗證JNK亞型的作用，最近發(fā)現的新的特異性抑制劑等為研究JNK亞型的功能提供了可能。 本研究中，我們采用BH3模擬物S1處理人卵巢癌耐藥細胞，以高通量方式對UPR信號通路相關84個基因進行篩選，發(fā)現JNK3持續(xù)高表達，并通過應用特異性抑制劑Ⅻ和siRNA對JNK3表達在人卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP中的作用及機制進行了探討。 方法 (1) MTT法檢測BH3模擬物S1處置卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP存活率。 (2) S1處置卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP，采用PCR array法檢測UPR信號通路84種基因變化，篩選差異表達基因；qPCR確認JNK1、JNK2和JNK3表達基因變化；Western Blot分析JNK3蛋白表達變化。 (3)根據JNK3的基因序列（GenBank：NM_002753）以及RNAi設計原理，構建三條寡核苷酸序列沉默其表達，命名為Si1，Si2和Si3，并通過熒光標簽、RT-PCR、Western blot等技術進行驗證，篩選有效沉默序列。 (4)利用JNK3特異性抑制劑Ⅻ和siRNA進行干預，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測細胞存活率；TUNEL染色法檢測凋亡變化。 (5)利用JNK3特異性抑制劑Ⅻ和siRNA進行干預，Western blot分析Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白的表達；Western blot分析JNK下游信號分子c-Jun、p-c-Jun、p53、Noxa和Bax蛋白表達變化；JC-1染色流式細胞術檢測線粒體膜電勢的變化；同時，Western blot分析細胞內質網應激相關蛋白Grp78和CHOP的表達。 (6) DCFH-DA染色觀察人卵巢癌耐藥細胞ROS水平；抗氧化劑NAC預處理細胞后合用S1和抑制劑Ⅻ，MTT法檢測細胞存活率。 (7) AO及Lyso-Tracker Red染色檢測胞內酸性結構累積情況；Western blot檢測LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達；自噬抑制劑氯喹與S1合用檢測存活率。 結果 1. MTT檢測顯示，S1能夠劑量依賴性及時間依賴性降低卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP的存活率。 2. PCR array法檢測結果顯示，在短時間點（3h）UPR信號通路多種未折疊蛋白伴侶分子（包括PERK、ATF6和IRE1三條應答途徑）表達上調應答了應激，長時間點（24h）則呈下降趨勢，表明ERS趨緩，而JNK3則持續(xù)高表達，同時JNK家族其他亞型無明顯變化。Western blot檢測也顯示JNK3蛋白水平表達上調。 3.結合mRNA及Western blot檢測確認Si3為JNK3有效沉默序列。 4.較之S1處理，抑制劑Ⅻ和siRNA干預后，光鏡下皺縮細胞增多；細胞存活率顯著降低；抑制劑Ⅻ與S1聯合應用后細胞凋亡率增加。 5.較之S1處理，抑制劑Ⅻ或siRNA與S1合并干預后，Bcl-2表達降低，同時Cleaved Caspase-3蛋白的表達增加；JNK靶標分子c-Jun、p-c-Jun表達明顯下降；而c-Jun的負性調節(jié)靶標p53表達上調，相應地，p53下游分子Noxa和Bax表達亦明顯上調；線粒體膜電位顯著下降；未折疊蛋白反應伴侶分子Grp78表達降低、CHOP表達升高。 6.抑制劑Ⅻ與S1聯合應用后，胞內ROS水平顯著增加，氧化損傷導致的存活率降低可被抗氧劑NAC所逆轉。 7. AO及Lyso-Tranker Red染色結果顯示抑制劑Ⅻ與S1聯合應用后胞內酸性結構明顯增多；同時LC3-Ⅱ表達在S1組、S1合并Ⅻ處理組均顯著增加，p62表達在合并處理組顯著增加，相應地siRNA干預后也呈現出LC3-Ⅱ和p62表達升高的趨勢；氯喹合并S1處理SKOV3/DDP細胞進一步降低了存活率。 結論 1. BH3模擬物S1能夠降低卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP存活率；UPR相關基因JNK3的高表達可能與SKOV3/DDP對BH3模擬物S1的敏感性密切相關。 2.抑制JNK3可通過阻斷其下游靶蛋白c-Jun的活化，誘導p53表達增加，，上調凋亡相關蛋白Noxa和Bax的表達，從而加劇S1誘導卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP凋亡。 3.抑制JNK3通過促進細胞氧化損傷從而提高了卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP對BH3模擬物S1的敏感性。 4.抑制JNK3通過阻斷細胞自噬通量從而提高了卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP對BH3模擬物S1的敏感性。 本文首次探討了JNK家族的亞型JNK3在卵巢癌細胞耐藥中的作用，JNK3可能通過減少氧化損傷和激活自噬途徑發(fā)揮了促進細胞存活的作用。因此JNK3可能是逆轉腫瘤細胞耐藥的一個潛在靶標。
【圖文】：

圖 1.1 Bcl-2家族蛋白調控細胞凋亡途徑[30]第二種模式（間接活化模式）表明Bak不與任何BH3-only蛋白結合，并且Bax和Bak在未與公認的BH3-only活化因子（Bim，Bid）結合的情況下，甚至是缺乏Bim或Bid、Puma減少的情況下仍可以誘導凋亡[31]。雖然現在還需要進一步研究來闡明Bcl-2家族蛋白誘導凋亡的調控機制，充分理解Bcl-2的生物途徑，但是靶向Bcl-2家族蛋白的藥物已經進入腫瘤學臨床試驗。不同于大部分促進增殖的致癌基因，Bcl-2通過抵抗程序性細胞死亡來發(fā)揮其功能[32]。由于Bcl-2家族抗凋亡蛋白通過抵抗凋亡促進細胞存活，并且在癌細胞中抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白可以誘導顯著的凋亡現象[33]，這就為我們提供了治療靶點。因為在85%的濾泡性淋巴瘤和20%的彌散性B細胞淋巴瘤中存在特異性的Bcl-2染色體異位t（14,18），這就導致了Bcl-2基因表達在轉錄水平失調[34]。最初對Bcl-2生物效應的體內研究是在Bcl-2轉基因小鼠中進行的，可以發(fā)現在轉基因小鼠中Bcl-2的過表達集中于B和T淋巴細胞中，導致了濾泡增殖或者T細胞

淋巴瘤[35]。圖1.2 直接活化和間接活化模式示意圖[36]通常，高水平的Bcl-2和Bcl-XL與惡性表型和多種惡性血液病以及實體瘤的化療藥物的耐藥密切相關[37]。譬如，前列腺癌中高水平Bcl-2與高Gleason分級以及前列腺切除術后高復發(fā)比率相關[38]。NCI60細胞系Bcl-XL的表達與多種化療藥物的耐藥密切相關，有關卵巢癌A2780及SKOV3細胞系的研究也得出相同結論[39-41]。研究發(fā)現在急性髓細胞性白血病和急性淋巴細胞性白血病中Bcl-2在RNA水平和/或蛋白水平是過表達的[42, 43]，而Bcl-2/Bax的比率與急性髓細胞性白血病和急性淋巴細胞性白血病的預后成負相關[44]。盡管體內實驗表明調控Bcl-2可以增加癌癥細胞對化療藥物的敏感性，但是Bcl-2的表達水平并不影響急性淋巴細胞性白血病的無事件生存率和腫瘤轉移[45]，這可能是由于Bcl-2家族成員間存在復雜的交互作用。因此，我們推測，Bcl-2家族是通過調節(jié)促凋亡、抗凋亡蛋白間的平衡來調控癌癥細胞死亡
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 楊念念;嚴亞瓊;龔潔;張思維;鄭榮壽;陳萬青;;中國2003～2007年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J];中國腫瘤;2012年06期

本文編號：2564250