【摘要】：【背景】 盆底器官脫垂(Pelvic organ prolapse， POP)是中老年女性的常見疾病，嚴(yán)重影響患者身心健康。大樣本流行病學(xué)調(diào)查顯示妊娠、分娩、絕經(jīng)、高齡、慢性腹壓增加是該病的主要危險(xiǎn)因素。目前認(rèn)為上述因素導(dǎo)致的盆底支持組織的損傷和修復(fù)障礙是POP發(fā)生的主要機(jī)制。按照基因組學(xué)和遺傳學(xué)的理論，疾病發(fā)生的分子基礎(chǔ)是基因缺陷，人類幾乎所有的疾病都與基因缺陷存在直接或間接關(guān)系。國內(nèi)外多項(xiàng)遺傳、流行病學(xué)調(diào)查的研究都提示遺傳因素參與盆底POP的發(fā)生、發(fā)展。雖然病因?qū)W研究已經(jīng)從宏觀意義上日漸證實(shí)POP發(fā)生發(fā)展的主要原因是盆底支持組織的損傷，然而這些研究多局限于疾病表觀以及形態(tài)學(xué)改變等方面，尚沒有哪種分子機(jī)制得到深入研究并為廣泛接受。一般認(rèn)為基因缺陷導(dǎo)致盆底細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能異常是POP發(fā)生發(fā)展的重要分子基礎(chǔ)。膠原纖維作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，以筋膜、韌帶等形式給予盆底組織抗拉伸強(qiáng)度，在維持盆底器官正常位置和功能中發(fā)揮重要作用。膠原的含量、分布和排列是維持組織功能的重要因素，一旦發(fā)生改變，在一定程度會(huì)影響盆底支持組織的性能及生物力學(xué)構(gòu)建，從而促使POP的發(fā)生發(fā)展。已知膠原有28種亞型，在不同組織中膠原亞型的分布不同，差異巨大，在韌帶組織中，I型膠原為主，在陰道壁組織中，以Ⅲ型膠原為主。目前國內(nèi)外許多學(xué)者從膠原含量、膠原亞型比例的變化等方面揭示了POP發(fā)生的分子特征[1-3]。這些研究由于采集的組織樣本不同、研究方法不同等原因，尚沒有形成觀點(diǎn)一致的結(jié)論。因此，明確POP患者盆底組織內(nèi)膠原蛋白表達(dá)模式并探討其合成和降解的調(diào)控途徑，有助于闡明POP發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，有助于立足發(fā)病機(jī)制制定有效的干預(yù)策略。 microRNA（miRNA）是一類長約20-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)。研究表明成熟的miRNA能降解靶mRNA或者阻遏靶mRNAs的翻譯而發(fā)揮表觀調(diào)控效應(yīng)。miRNA通過負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與基因組30%基因的表達(dá)調(diào)控，包括發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等多種生理及病理過程。近年來，miRNA對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控研究引起高度重視，其中膠原蛋白、層粘連蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β、彈性蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)調(diào)控，涉及miR-590，miR-155，miR-7， miR-21，miR-30、miR-29及miR-133等多個(gè)家族，在發(fā)育分化、增殖凋亡、免疫調(diào)控、炎性浸潤、腫瘤遷移等方面取得一定進(jìn)展[4-6]。基于對(duì)miRNA這一表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的逐步了解，為研究POP發(fā)生發(fā)展相關(guān)miRNA的分子機(jī)制提供了新思路及可供借鑒的實(shí)踐方法。 當(dāng)前，應(yīng)用高通量芯片技術(shù)進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析、生物信息學(xué)預(yù)測及鑒定其靶基因以及進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)方法得到廣泛應(yīng)用。特別是探索組織特異性miRNA在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能，可揭示其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，為miRNA在疾病基因診斷、治療的臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。陰道前壁包含膀胱陰道筋膜，與韌帶等其它盆底結(jié)締組織有著共同的胚胎起源[7]，是盆底支持組織中最常和最易受損傷的部位，其成分改變可間接反映盆內(nèi)筋膜的變化[8,9]。理解其形態(tài)功能及其對(duì)應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于闡明POP的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。迄今為止，國內(nèi)外尚無POP組織特異性miRNA表達(dá)譜分析的研究報(bào)道。因此開展對(duì)POP患者的陰道壁miRNA表達(dá)譜分析，并結(jié)合生物信息學(xué)深入探討其對(duì)POP發(fā)病基礎(chǔ)的細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控研究，不僅有其理論上的可行性及實(shí)踐上的可操作性，還有較廣闊的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。 【目的】 本研究以高通量芯片技術(shù)檢測為基礎(chǔ)，探尋差異表達(dá)miRNA，以期構(gòu)建絕經(jīng)后POP陰道壁組織miRNA表達(dá)譜，為POP領(lǐng)域miRNA的研究指明方向；借助已有的生物信息學(xué)平臺(tái)，對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，以期以miRNA為出發(fā)點(diǎn)，構(gòu)建絕經(jīng)后POP陰道壁組織基因表達(dá)譜，從而有效縮小POP領(lǐng)域候選基因研究范圍，使得后續(xù)基因研究更有可行性和科學(xué)性；從mRNA和蛋白水平開展研究，以期明確盆底組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)模式，從而揭示膠原參與POP進(jìn)展的分子基礎(chǔ)；開展靶向調(diào)控研究，觀察靶標(biāo)mRNA表達(dá)水平的變化，以期明晰miRNA對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成、代謝及降解轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，從而揭示miRNA參與POP進(jìn)展的分子基礎(chǔ)，為闡明POP發(fā)病機(jī)制提供新思路；為開發(fā)個(gè)體化的POP預(yù)警、療效判斷及預(yù)后指標(biāo)及分子水平的基因診治技術(shù)提供新視角。 【方法】 1.嚴(yán)格匹配年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、體重指數(shù)、陰道分娩次數(shù)以及相關(guān)病史等POP發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，選取5例絕經(jīng)后POP與5例絕經(jīng)后無POP患者，以陰道前壁正中近穹窿處組織為研究樣本。 2.用mirVana miRNA Isolation Kit提取total RNA，檢測其純度、總量及完整性，F(xiàn)lashTag Biotin RNA Labeling Kit進(jìn)行生物素標(biāo)記，然后用Affymetrix GeneChip miRNA Array3.0進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，利用SAM（significance analysis ofMicroarrays）R程序包分析差異miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)是：Fold Change≥2提示表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)old Change≤0.5提示表達(dá)下調(diào)；Q-value≤5%提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.借助生物信息學(xué)技術(shù)，運(yùn)用TargetScan、PicTar和miRanda等軟件對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。為了減少假陽性率，，提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，挑選出同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)預(yù)測軟件中的基因，作為其可能的候選靶基因，以miRNA為出發(fā)點(diǎn)，構(gòu)建絕經(jīng)后POP陰道壁組織基因表達(dá)譜。 4.查閱國內(nèi)外POP相關(guān)基因組學(xué)研究文獻(xiàn)，總結(jié)出與POP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)基因。 5.復(fù)合分析生物信息學(xué)軟件預(yù)測的miRNA靶基因與基因組學(xué)研究揭示的差異表達(dá)基因，篩選出共有基因作為研究對(duì)象。 6.進(jìn)一步擴(kuò)大POP組和對(duì)照組樣本量至各組10例，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot技術(shù)分析絕經(jīng)后POP組和對(duì)照組差異miRNA及其靶基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證miRNA芯片的準(zhǔn)確性。 7.釣取miRNA靶基因3’UTR區(qū)的基因序列，并將其克隆到psiCHECKTM-2載體3'UTR區(qū)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建靶基因的野生型報(bào)告載體；對(duì)靶基因3'UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，并將其克隆到psiCHECKTM-2載體3'UTR區(qū)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有miRNA突變靶位點(diǎn)的突變型報(bào)告載體；將這兩個(gè)載體分別與miRNA mimics、mimics negative control（mimics NC）共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶活性變化。 【結(jié)果】 1.對(duì)提取的組織total RNA進(jìn)行紫外分光光度計(jì)分析，顯示total RNA量在9.89ug到21.88ug之間，A260/280在1.99到2.03之間；電泳條帶清晰，RNA完整性好；樣品RNA滿足Affymetrix GeneChip miRNA3.0芯片要求。 2.10張Affymetrix GeneChip miRNA3.0芯片的各項(xiàng)檢測參數(shù)，包括B2Oligo的雜交表現(xiàn)、芯片的平均背景值以及噪音值、Spike-in Control Oligos以及EukaryoticHybridization Controls的信號(hào)值均滿足芯片質(zhì)控要求，提示樣品與AffymetrixGeneChip miRNA3.0芯片的雜交模型建立成功。 3. Affymetrix GeneChip miRNA3.0表達(dá)譜芯片共篩選出44個(gè)在絕經(jīng)后POP患者陰道壁組織中呈2倍以上表達(dá)上調(diào)的miRNA。 4.生物信息學(xué)方法預(yù)測差異miRNA的靶基因，與已有的基因芯片研究成果進(jìn)行交叉比對(duì)、雙向篩選，最終確定hsa-miR-196a作為下一步研究對(duì)象，并預(yù)測COL3A1為其候選靶基因。 5.擴(kuò)大樣本含量至每組10例組織標(biāo)本，熒光定量實(shí)時(shí)PCR提示hsa-miR-196a在絕經(jīng)后POP組表達(dá)顯著上調(diào)，達(dá)21.71倍。 6.熒光定量實(shí)時(shí)PCR及Western Blot從mRNA和蛋白水平證實(shí)POP患者陰道壁組織中COL3A1的表達(dá)水平顯著下調(diào)。 7.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測顯示：在轉(zhuǎn)染克隆有COL3A1基因3'UTR區(qū)的野生型報(bào)告載體的實(shí)驗(yàn)中，hsa-miR-196a mimics組與空白對(duì)照組以及hsa-miR-196aNC組相比，熒光素酶活性顯著下降，僅為hsa-miR-196a NC組的48%，hsa-miR-196a NC組與空白對(duì)照組相比，熒光素酶活性無明顯變化；在轉(zhuǎn)染克隆有COL3A1基因3'UTR區(qū)的突變型報(bào)告載體的實(shí)驗(yàn)中，hsa-miR-196a mimics組與空白組和hsa-miR-196a NC組相比較，熒光素酶活性無明顯差異。 【結(jié)論】 1.芯片是研究miRNA的重要手段，miRNA芯片技術(shù)使得篩選與特定的生長發(fā)育階段或者特定的疾病相關(guān)的miRNA更為容易和便捷。本研究Affymetrix GeneChipmiRNA3.0表達(dá)譜分析共篩選出44個(gè)在POP患者陰道壁組織中呈2倍以上表達(dá)上調(diào)的miRNA，推測這些miRNA可能參與了POP的發(fā)生、發(fā)展。 2. COL3A1表達(dá)失衡是POP發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，其在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào)。 3. hsa-miR-196a在絕經(jīng)后POP患者陰道壁組織中顯著上調(diào)，COL3A1是其靶基因，hsa-miR-196a的種子序列通過與COL3A13'UTR區(qū)結(jié)合誘導(dǎo)COL3A1mRNA降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)COL3A1的負(fù)向調(diào)控。 4. hsa-miR-196a參與了POP的發(fā)生、發(fā)展。在POP中，hsa-miR-196a表達(dá)水平顯著上調(diào)，通過負(fù)向調(diào)控靶標(biāo)COL3A1，導(dǎo)致陰道組織III型膠原含量下降，可能是POP發(fā)生的重要機(jī)制之一�？紤]到陰道壁組織的膠原構(gòu)成是以Ⅲ型膠原為主，這種機(jī)制顯得更為重要。miRNA為探索盆底功能障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視野。 【展望】 本研究發(fā)現(xiàn)了44個(gè)在POP患者陰道壁組織中呈2倍以上表達(dá)上調(diào)的miRNA，考慮到每個(gè)miRNA都可能存在數(shù)十個(gè)甚至幾百個(gè)靶基因，而每個(gè)靶基因可能接受多個(gè)miRNA的調(diào)控，后續(xù)還有很多工作要做，miRNA參與POP發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究才剛剛開始。 miRNA只有20個(gè)堿基左右，成熟后即刻被蛋白質(zhì)包裹，不易被RNase降解，可以穩(wěn)定存在于血液、尿液等體液中，因此非常容易進(jìn)行檢測。大量的研究表明，miRNA表達(dá)的失調(diào)是一些疾病過程的起因或者指示劑，它們的表達(dá)因疾病而異，這一發(fā)現(xiàn)說明miRNA的表達(dá)特征可作為疾病診斷和預(yù)防的生物標(biāo)志物。在POP領(lǐng)域的深入研究，有望從miRNAs層面預(yù)測POP易感人群，從而進(jìn)行早期干預(yù)，減少該類疾病的發(fā)生和進(jìn)展。此外，也有很多學(xué)者從靶向miRNA的角度或者miRNA誘導(dǎo)基因沉默的角度對(duì)疾病的治療進(jìn)行了探討，雖然尚未取得突破性進(jìn)展，但卻為我們治療POP提供了新的思路，指明了新的研究方向。
【圖文】：

1 Affymetrix miRNA 表達(dá)譜芯片檢測技術(shù)與芯片編號(hào)及分組ymetrix miRNA 3.0芯片編號(hào) RNA樣0200925544082314417985814250 121150200925544082314417985814267 121150200925544082314417985814203 121150200925544082314417985814244 121150200925544082314417985814219 121150200925544082314417985814197 121150200925544082314417985814213 121150200925542082314417985814046 121150200925544082314417985814248 121150200925544082314417985814199 12115

后的miRNA信號(hào)值，首先進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換，然后采用平均連鎖、層次聚類算法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果用聚類圖表示。數(shù)據(jù)處理流程如下（圖1-2）：圖1-2 芯片數(shù)據(jù)處理流程
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R711.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Carl Christoph Schimanski;Kirsten Frerichs;Fareed Rahman;Martin Berger;Hauke Lang;Peter R Galle;Markus Moehler;Ines Gockel;;High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells[J];World Journal of Gastroenterology;2009年17期

本文編號(hào)：2553213