【摘要】：研究背景染色體平衡易位是染色體結(jié)構(gòu)重排的一種,發(fā)生率約為1/625,其攜帶者通常沒有明顯的表型異常,但與反復(fù)流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、新生兒精神發(fā)育遲緩及其他先天畸形等不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的染色體平衡易位最多見的是染色體相互易位及羅伯遜易位。理論上染色體相互易位攜帶者減數(shù)分裂形成正常配子的概率為1：18,羅伯遜易位攜帶者形成正常配子的概率為1：6,所以通常建議所有的染色體平衡易位攜帶者做產(chǎn)前診斷。準備用輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology, ART)進行助孕治療的夫妻,若一方存在染色體平衡易位,則建議其行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)�？梢酝ㄟ^免疫熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)、陣列-比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization, aCGH)、單核苷酸多態(tài)性分析(single nucleotide polymorphism, SNP)對染色體平衡易位攜帶者的胚胎進行PGD,目前大多數(shù)國內(nèi)生殖中心多采用aCGH及SNP array技術(shù)。以二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)為基礎(chǔ)的拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing, CNV-Seq)以其高通量、高靈敏度、低成本在PGD以及植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening, PGS)中逐漸體現(xiàn)出其優(yōu)勢,不僅可以篩查胚胎的整倍體性,還可以檢測出基因拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)。鑒別染色體平衡易位攜帶者胚胎是正常胚胎還是染色體平衡易位胚胎,是染色體平衡易位攜帶者PGD的難點,目前的普遍做法是移植整倍體胚胎,不進行進一步鑒別,若將染色體平衡易位胚胎進行移植,其出生后仍存在和親代同樣的生育問題。因此,本實驗通過CNV-Seq技術(shù)對染色體平衡易位攜帶者進行PGD,驗證其效能的同時,采用mate pair文庫測序聯(lián)合PCR方法對正常胚胎以及平衡易位胚胎進行鑒別,為染色體平衡易位攜帶者PGD提供新的有效方法。研究目的1.證實以NGS為基礎(chǔ)的CNV-Seq技術(shù)在染色體平衡易位攜帶者PGD中的有效性;2.建立并優(yōu)化通過mate pair文庫測序區(qū)分染色體相互易位胚胎和正常胚胎的操作流程；3.驗證mate pair文庫測序聯(lián)合PCR鑒別染色體相互易位胚胎和正常胚胎的準確性;4.通過篩選后移植正常胚胎提高染色體相互易位攜帶者妊娠率。研究方法1.將納入病例女方予控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH),卵泡達到取卵要求時陰道B超監(jiān)測下取卵,取卵日男方采集精液,經(jīng)處理后行卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI),形成受精卵培養(yǎng),對卵裂球或囊胚期滋養(yǎng)層細胞進行活檢;2.胚胎細胞活檢,行全基因組擴增(whole genome amplification, WGA),測序,篩選出拷貝數(shù)正常胚胎;3.患者選擇整倍體胚胎進行移植,計算種植率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率;4.將納入mate pair文庫測序研究的夫妻染色體平衡易位的一方取靜脈血提取DNA,測序并建立mate pair文庫,尋找斷裂點;5.根據(jù)斷裂點設(shè)計并測試引物,通過PCR的方法用引物檢測已篩選出的正�；蛉旧w平衡易位胚胎基因組是否存在斷裂點,若存在即證明其為染色體平衡易位胚胎,否則為正常胚胎;6.將篩檢后胚胎進行植入,妊娠后18-20周取羊水,行羊水細胞染色體核型分析;7.將PCR檢測結(jié)果與胎兒染色體核型進行比對,判斷mate pair文庫測序的診斷效能。結(jié)果1.21對夫妻可供活檢的胚胎共113枚,其中98枚(86.7%)進行了CNV-Seq;成功篩查了胚胎的整倍體性,甚至發(fā)現(xiàn)了0.8Mb的微小拷貝數(shù)變化,并且發(fā)現(xiàn)了嵌合比例為20%的嵌合體;2.8對夫妻(38.1%)所有的胚胎均異常,無整倍體胚胎可移植,13對夫妻至少有一枚整倍體胚胎可供移植;均進行了解凍移植,種植率為78.6%,持續(xù)妊娠率為70%,活產(chǎn)率60%;3.成功優(yōu)化mate pair文庫測序與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法區(qū)分染色體相互易位胚胎和正常胚胎的操作流程,分別將2枚鑒別為完全正常的胚胎及2枚染色體平衡易位胚胎進行移植,成功妊娠;4.經(jīng)羊水穿刺對胎兒進行染色體核型分析,核型結(jié)果與PCR測試結(jié)果一致,證明mate pair文庫技術(shù)聯(lián)合PCR鑒別正常胚胎診斷準確。結(jié)論1.以NGS為基礎(chǔ)的CNV-Seq技術(shù)可用于染色體平衡易位攜帶者PGD,靈敏高效,取得較高的臨床種植率,持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率;2.進一步證實染色體平衡易位攜帶者的胚胎具有較高的非整倍體胚胎比率;3. CNV-Seq技術(shù)分辨率較高,除可檢測微缺失及微重復(fù)外,還可以發(fā)現(xiàn)嵌合體;4.將CNV-Seq技術(shù)、mate pair文庫測序技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合,可用于鑒別正常胚胎及染色體平衡易位胚胎。
【圖文】：

５１．７％，ｐ＝０．０８）；其余邋４邋篇文獻，包括邋Ｙａｎｇｗａ／．邋’邋ＲＣＴ（２０１２），Ｓｃｏ？ｅｆ邋R%．’邋ＲＣＴ逡逑（２０１３），Ｓｃｏｔｔｅｆａ／．＇化ｓｔｒａｃｔｏｆＲＣＴ（２０Ｈ）），Ｔｒｅｆｆｅｆａ／．＇＾ｓｔｒａｃｔｏｆＲＣＴ（２０１１）逡逑均得出了病例組臨床妊娠率明顯商于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖１．４。逡逑ＰＧ￥邐Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｏｄｄｓ邋Ｒａｔｉｏ邐Ｏｄｄｓ邋Ｒａｔｉｏ逡逑ｆｔｈｉｄｙ邋Ｏｆ邋Ｓｕｂｇｒｏｕｐ邋Ｅｖｎｔｍ邋Ｔｏｔａｌ邋Ｅｖｎｔｍ邋Ｔｏｔａｌ邋Ｗａｉｙｈｔ邋Ｍ－Ｈ．邋Ｒａｎｄｏｍ．邋９５％邋Ｃｌ邐Ｍ－Ｈ．邋Ｒａｎｄｏｍ．邋９５＾邋Ｃｌ逡逑Ｙａｎｇ邋２０１３邐４８邐７０邐３０邐６１邐１４．１％邐２．２５邋［１．１１，４．５９］逡逑Ｔｒｅｆｆ２０１１邐４６邐６７邐汾邐７７邐１５．３％邐２，１３邋［１邋朗．４邋２２］逡逑Ｓｃｏｎ邋ＪＲ邋２０１３邐８９邐１３４邐巧邐１邋的邐３２．０％邐２．１６邋［１邋３４．３邋４６］邐？逡逑？ｃｏｎ邋２０１０邐１８邐２４邐１５邋巧邋５．０％邐２．４０邋陽邋７３．７邋９刮邐邐邐邐逡逑Ｆｏｒｍａｎ邋２０１３邐妨邐。７邐８９邐１邋巧邐２５．５Ｘ邐１．說陽．９４，２．７２１邐？＂逡逑Ｆｆｉｏｒ？ｎｂｎｏ２０１３邐１３邐３７邐１３邐４６邋６．２％邐１．３８邋［０．５４，３．４９］邐—、￣逡逑ＴｏＵＭＭ％ＣＩ）邐４１９邐５４６邋１００．０％邐１．９５邋［１．４９

Ｆｏｒｍａｎ邋ｅｆａ／．邋’邋ＲＣＴ邋（２０１３），病例組與對照組流產(chǎn)率相比較，差異無明顯統(tǒng)計逡逑學(xué)意義（１１．５％ｗ２０％，片＝０．２），，ＹａｎｇＷｆｌ／．邋’邋ＲＣＴ邋（２０１２）病例紐與對照沮流產(chǎn)逡逑率相比較，病例組流產(chǎn)率明顯低于對照組（２．５％ｗｌｌ．８％，Ｐ＜化０５）。見圖１．６。逡逑９０．００％邋－１邐逡逑８０．００％邐＾邐逡逑７０．００％邐＾邐逡逑６０．００％邐＾邐逡逑５０．００％邋—邋—邐邋■邋ＰＧＳ逡逑４０．００％邐＾邐逡逑３０．００％邋—＾Ｈ邐邋■眶ＲＯＬ逡逑——＾＾邐逡逑１０．００％邐＾＾邐逡逑０．００％邋－Ｉ邐＾＾邐，逡逑Ｓｃｏｔｔ邋２０１３邐Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ邋Ｆ２０１３逡逑圖１．５邋Ｓｃｏｔｔ民ＣＴ與Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ邋Ｆ邋ＲＣＴ活產(chǎn)率比較逡逑２５．００％邋１邐逡逑２０．００％邐邐逡逑巧．００％邐邐逡逑＿＿邐■邋ＰＧＳ逡逑１０‘００％邐＾邐邋■邐ＣＯＮＴＲＯＬ逡逑邐＾＾邐逡逑０．００％邋－１邐＾＾邐，逡逑Ｆｏｒｍａｎ邋２０１３邐Ｙａｎｇ邋２０１２逡逑圖１．６邋Ｆｏｒｍａｎ邋ＲＣＴ與Ｙａｎｇ邋ＲＣＴ流產(chǎn)率比較逡逑１．４討論逡逑１．４．１結(jié)論逡逑將納入研究各項臨床指標經(jīng)ｍｅ化分祈Ｗ后，發(fā)現(xiàn)ＰＧＳ－ＣＣＳ可Ｗ提高ＡＲＴ逡逑過程中臨床妊娠率及持續(xù)妊娠率
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8

【相似文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張雯珂;Mate pair文庫測序在染色體相互易位PGD中的應(yīng)用[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2016年

本文編號：2552729