發(fā)布時間：2019-09-29 17:18

【摘要】：目的:日常生活中塑化劑應(yīng)用所致生殖損傷等問題已引起社會廣泛關(guān)注,本課題旨在觀察常見塑化劑三鄰甲苯磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)暴露對雌性小鼠卵巢功能損傷及原始卵泡發(fā)育的影響,并檢測Hippo信號通路在介導(dǎo)TOCP對卵巢功能損傷中的作用及調(diào)控,為進(jìn)一步了解塑化劑的雌性生殖毒性增添新資料,為女性不孕癥的防治、婦女絕經(jīng)期提前及卵巢功能早衰的治療提供新思路。方法:1.建立小鼠TOCP染毒模型,分為對照組(0 mg/kg/d)、低劑量組(100mg/kg/d)、中劑量組(200 mg/kg/d)、高劑量組(400 mg/kg/d),每組10只小鼠,按照上述濃度連續(xù)灌胃1個月。檢測卵巢指數(shù)及血E2和P0變化;HE染色觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù);TUNEL熒光染色檢測卵泡凋亡情況;Western Blotting檢測促凋亡因子BAX和抑凋亡BCL-2的表達(dá)變化;Western Blotting同步檢測Hippo信號分子MST1、LATS2、YAP1、P-MST1、P-YAP1的表達(dá)變化。2.建立原始卵泡TOCP體外培養(yǎng)模型,分為0 mM、0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM劑量組,利用HE染色、卵泡計(jì)數(shù)和TUNEL染色等方法觀察TOCP暴露對原始卵泡發(fā)育的影響;Western Blotting同步檢測Hippo信號分子MST1、LATS2、YAP1、P-MST1、P-YAP1的表達(dá)變化。3.構(gòu)建Hippo信號通路下游效應(yīng)分子YAP1慢病毒過表達(dá)載體,通過卵巢顯微注射方式,建立TOCP(200 mg/kg)-YAP1小鼠模型。檢測卵巢指數(shù)的變化,HE染色觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù);Western Blotting檢測促凋亡因子BAX和抑凋亡BCL-2的表達(dá)變化,并通過整體交配方法觀察其生仔率。4.建立原始卵泡TOCP(0.5 mM)-YAP1體外培養(yǎng)模型。HE染色觀察小鼠卵巢的形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù);免疫熒光染色檢測GFP的表達(dá)變化。結(jié)果:1.卵巢指數(shù)結(jié)果顯示:與對照組相比,100、200和400 mg/kg TOCP處理組小鼠卵巢指數(shù)呈劑量依賴性降低(p0.05,p0.01)。激素檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,100、200和400 mg/kg TOCP處理組小鼠血E2水平均升高(p0.05);血P0水平降低(p0.05,p0.01)。HE染色結(jié)果顯示:在100 mg/kg TOCP濃度組中,卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕微的變形以及卵泡數(shù)目減少;在200和400 mg/kg TOCP濃度組中,卵巢結(jié)構(gòu)明顯被破壞,各級卵泡形態(tài)顯著異常,且卵泡數(shù)目急劇下降。卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:與對照組相比,100、200和400 mg/kg TOCP處理組小鼠原始卵泡、竇前卵泡及成熟卵泡數(shù)目顯著減少,閉鎖卵泡則顯著增加。TUNEL熒光染色結(jié)果顯示:隨著TOCP劑量增加,凋亡卵泡數(shù)目呈劑量依賴式增加。通過統(tǒng)計(jì)凋亡率發(fā)現(xiàn),與對照組比較,100、200和400 mg/kg TOCP處理組小鼠卵巢卵泡凋亡率呈劑量依賴式升高(p0.01,p0.001)。Western Blotting結(jié)果顯示:與對照組相比,100、200和400 mg/kg TOCP處理組BAX/BCL-2的值均顯著增高(p0.001)。Western Blotting同步檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,100、200和400 mg/kg TOCP處理組小鼠卵巢MST1和LATS2蛋白表達(dá)量均升高(p0.05,p0.01),而YAP1蛋白表達(dá)量顯著降低(p0.05,p0.01),P-MST1/MST1比值降低(p0.05),但P-YAP1/YAP1比值顯著升高(p0.01)。2.HE染色結(jié)果顯示:在Blank組和0 mM濃度組中,卵巢組織結(jié)構(gòu)完整,卵泡形態(tài)正常,部分原始卵泡生長發(fā)育變?yōu)槌跫壜雅?在0.125 mM濃度組中,卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕微的變形,卵泡數(shù)目顯著降低;在0.25 mM和0.5 mM濃度組中,卵巢結(jié)構(gòu)明顯被破壞,卵泡形態(tài)顯著異常,閉鎖卵泡增多且總卵泡數(shù)目急劇下降;在1 mM濃度組中,卵巢結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,幾乎沒有發(fā)現(xiàn)卵泡存在。卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:與對照組相比,0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM和1 mM處理組乳鼠卵巢中原始卵泡、初級卵泡及卵泡總數(shù)顯著減少。TUNEL熒光染色結(jié)果顯示:隨著TOCP劑量增大,卵泡細(xì)胞凋亡越明顯,細(xì)胞凋亡數(shù)目越多。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:對照組乳鼠卵巢中正�；蛘谠鲋车穆雅菁�(xì)胞幾乎沒有發(fā)生凋亡,陽性細(xì)胞數(shù)量很少;0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM處理組乳鼠卵巢存在較多的凋亡細(xì)胞,被染成棕色,而且隨著劑量增大,卵泡細(xì)胞凋亡越明顯,細(xì)胞凋亡數(shù)目越多。Western Blotting結(jié)果顯示:與對照組相比,0.125 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM處理組小鼠卵巢MST1未出現(xiàn)顯著差異,LATS2表達(dá)量升高,(p0.05,p0.01,p0.001),而YAP1表達(dá)量顯著降低(p0.05,p0.01),P-MST1/MST1比值降低(p0.05,p0.01),但P-YAP1/YAP1比值顯著升高(p0.05,p0.01)。3.卵巢指數(shù)結(jié)果顯示:與對照組相比,Vector組無顯著差異,Vector-YAP1組小鼠卵巢指數(shù)明顯升高(p0.01)。HE染色和卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:與對照組相比,Vector-YAP1組小鼠卵巢原始卵泡數(shù)顯著下降,竇前卵泡和成熟卵泡數(shù)顯著升高,閉鎖卵泡數(shù)顯著下降(p0.01,p0.001)。Western Blotting結(jié)果顯示:與對照組相比,Vector組BAX/BCL-2比值無明顯變化,Vector-YAP1組BAX/BCL-2比值顯著降低(p0.001)。整體交配結(jié)果顯示:Vector-YAP1組子代出生率增加(p0.05)。4.免疫熒光結(jié)果顯示:YAP1過表達(dá)慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體均可有效轉(zhuǎn)染乳鼠的卵巢組織。HE和卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:與0.5 mM TOCP組相比,0.5 mM TOCP+Vector-YAP1組中原始卵泡數(shù)目減少,正在發(fā)育的卵泡數(shù)目顯著增多。結(jié)論:1.TOCP暴露影響卵巢功能致雌性生殖損傷。2.Hippo信號通路表達(dá)異常是TOCP所致雌性生殖損傷的病理學(xué)機(jī)制之一。
【圖文】：

圖 1 卵巢指數(shù)Fig. 1 ovarian coefficient.不同濃度 TOCP（0、100、200、400 mg/kg）處理 1 個月后的小對照組比較；# p<0.05，與低劑量組比較。P 亞慢性暴露對血 E2和 P0水平的影響

圖 2 TOCP 亞慢性暴露對小鼠血 E2和 P0水平的影響Fig. 2 Effect of TOCP exposure on secretion of E2and P0in experimental female miceA 圖為不同濃度組小鼠血 E2水平，B 圖為不同濃度組小鼠血 P0水平；* p<0.05，** p<0.01，與對照組比較；# p<0.05，與低劑量組比較。3.1.3 TOCP 亞慢性暴露下卵巢形態(tài)學(xué)與卵泡計(jì)數(shù)變化
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R711

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本文編號：2544044