【摘要】：MicroRNA (miRNA),通常被認(rèn)為是長(zhǎng)度為18～22nt的單鏈RNA分子,這種短RNA分子通過(guò)配對(duì)靶標(biāo)mRNA分子,可以形成沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)從而降解mRNA,控制蛋白質(zhì)的合成。研究表明microRNA參與了一系列重要的生理過(guò)程,并且與腫瘤及多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。循環(huán)核酸一直以來(lái)是生物學(xué)家關(guān)注的重點(diǎn),尤其是循環(huán)miRNA作為一種穩(wěn)定存在血漿/血清中的RNA分子,它們的含量和組成與癌癥、產(chǎn)前疾病、糖尿病在內(nèi)的各種疾病密切相關(guān)。自從循環(huán)系統(tǒng)中鑒定出miRNAs以來(lái),不少文獻(xiàn)指出血漿/血清中的miRNA可以作為疾病的有效生物標(biāo)志物,但是卻很少有研究提及血漿/血清中的miRNA的來(lái)源以及穩(wěn)定的原因。外囊體(exosomes)是細(xì)胞分泌至胞外的直徑為30-100 nm的微囊泡,在機(jī)體體液中廣泛存在。Exosomes攜帶有大量特異蛋白組分,同時(shí)包裹有數(shù)目可觀的miRNAs,在某些病理或生理?xiàng)l件下,某些特定的miRNA群體會(huì)被選擇性地包裹進(jìn)微囊泡之中。Exosomes作為循環(huán)miRNA重要的載體可以保護(hù)miRNA,這就從一方面解釋了為何循環(huán)miRNA在充斥著核糖核酸酶的循環(huán)系統(tǒng)中能夠穩(wěn)定存在的原因。女性生殖疾病和妊娠過(guò)程受到激素等分子的高度調(diào)控,同時(shí)有證據(jù)表明miRNA參與了人類(lèi)乃至哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程。經(jīng)研究證實(shí),孕婦血漿/血清中存在胎盤(pán)來(lái)源的miRNAs.子癇和妊娠糖尿病都是妊娠期的常見(jiàn)疾病,發(fā)病機(jī)制尚未清楚,目前用于篩查妊娠期疾病的方法準(zhǔn)確性、敏感度普遍不高,子宮內(nèi)膜癌是一類(lèi)在女性生殖系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的惡性腫瘤,目前在此方面的研究主要集中在激素和mRNA的表達(dá)差異方面。尋找與妊娠及生殖腫瘤相關(guān)的調(diào)控miRNA具有重要意義,可以深入探討分子調(diào)控機(jī)制,并進(jìn)而尋找新的分子標(biāo)記物,這對(duì)生殖系統(tǒng)疾病的早期診斷有重要的意義。高通量測(cè)序平臺(tái)在miRNA的研究中已經(jīng)得到了深入廣泛的應(yīng)用,但是目前研究中針對(duì)微量循環(huán)miRNA測(cè)序分析的技術(shù)還不夠完善,因此發(fā)展可靠的微量miRNA的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)于循環(huán)miRNA的研究乃至未來(lái)的無(wú)創(chuàng)臨床診斷有基礎(chǔ)性的作用。同時(shí)高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生了海量miRNA數(shù)據(jù),充分利用測(cè)序數(shù)據(jù)將利于我們追蹤疾病的發(fā)病機(jī)制,幫助提高診斷的特異性和靈敏性。本論文首先建立了Exosome中內(nèi)含的核酸提取平臺(tái),就exosome提取純化方法、exosome中DNA的分布特點(diǎn)以及exosome中RNA的穩(wěn)定性等進(jìn)行了探索研究；然后針對(duì)Exosome中miRNA含量極低的特點(diǎn),結(jié)合目前較為成熟的建庫(kù)試劑盒,建立了微量循環(huán)miRNA的高通量測(cè)序建庫(kù)平臺(tái)。利用建立好的平臺(tái),我們對(duì)妊娠糖尿病人、子癇病人的胎盤(pán)和血漿中的游離miRNA進(jìn)行了高通量檢測(cè),篩選出差異表達(dá)的血漿miRNA,為研究疾病標(biāo)志物提供依據(jù)；最后針對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)高通量的特點(diǎn),基于niRNA簇／家族、miRNA異構(gòu)體的分析技術(shù)對(duì)已有數(shù)據(jù)進(jìn)行了探索研究。本論文主要研究?jī)?nèi)容和成果如下：1.血漿循環(huán)微囊泡及其核酸的表征血漿中的循環(huán)核酸,尤其是miRNAs,在核糖核酸酶等影響下仍然能保持完整性,這表明在血漿環(huán)境中存在某種保護(hù)核酸不被降解的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)核酸可以與血漿中囊泡樣亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(exosome)結(jié)合,而囊泡結(jié)構(gòu)可以將核酸與復(fù)雜的體外環(huán)境隔離,這可能是循環(huán)miRNAs表達(dá)穩(wěn)定的重要原因之一。本論文對(duì)血漿中循環(huán)微囊泡進(jìn)行了一系列表征和檢測(cè),為研究循環(huán)微囊泡尤其是其中的核酸的性質(zhì)提供了基礎(chǔ)性的工作。我們使用不依賴(lài)超速離心的試劑盒方法分離純化exosome,進(jìn)行電鏡和粒度分析表征,從形態(tài)和大小分布上確認(rèn)了提取的exosome直徑在50-70nm。血漿exosome DNA質(zhì)控結(jié)果顯示,exosome DNA比血漿游離DNA多出400-600bp的DNA分布。我們?cè)谠囼?yàn)中分別比較了在4℃和-80℃下儲(chǔ)存不同時(shí)間段以及新鮮獲得的血漿及分離的exosome中RNA的濃度差異,結(jié)果表明exosome中RNA相對(duì)于血漿游離RNA的穩(wěn)定性增強(qiáng),不同條件下濃度波動(dòng)較小。此外我們還選擇了特定miRNA研究其在exosome內(nèi)外的表達(dá)差異,進(jìn)一步證實(shí)了exosome中miRNA穩(wěn)定性很高。最后,我們?yōu)榱颂剿鞑煌拇鎯?chǔ)條件對(duì)miRNA表達(dá)水平的影響,對(duì)血漿樣本進(jìn)行反復(fù)凍融,然后與新鮮樣本進(jìn)行比較。結(jié)果顯示對(duì)血漿RNA有很大的影響,但在exosome中miRNA的下降速度明顯低于相應(yīng)的血漿游離miRNA。2.微量循環(huán)miRNA測(cè)序文庫(kù)制備方法的研究外周血液中的循環(huán)miRNA相對(duì)于組織中而言含量低,增加了高通量測(cè)序的建庫(kù)難度,優(yōu)化和改進(jìn)針對(duì)微量循環(huán)miRNA的建庫(kù)方法有利于循環(huán)miRNA的研究以及在臨床上的應(yīng)用推廣。我們基于以前的工作,在定量PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上提出了一種無(wú)偏性的單鏈連接構(gòu)建miRNA測(cè)序文庫(kù)的方案,在單鏈接頭的5’端引入了兩個(gè)隨機(jī)引物；同時(shí)對(duì)單鏈接頭的5’端進(jìn)行預(yù)腺苷�；ｋS機(jī)通用接頭和固定接頭的定量PCR結(jié)果表明,隨機(jī)引物的引入可以降低了鏈接的偏性,而固定序列接頭與同樣的miRNA鏈接時(shí)呈現(xiàn)出了明顯的差異性。我們針對(duì)兩種典型樣本濃度,使用不同濃度的接頭進(jìn)行連接,通過(guò)PCR結(jié)果確定了高、低樣本濃度下合適的接頭濃度,并且驗(yàn)證了最適接頭濃度與不同濃度原始樣本鏈接后的線(xiàn)性范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方法的檢測(cè)線(xiàn)性范圍能夠達(dá)到8個(gè)數(shù)量級(jí)。我們將自己的建庫(kù)方案與現(xiàn)有的商品化建庫(kù)試劑盒進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩種方法獲得的miRNA表達(dá)水平具有高度的一致性,從而證明了基于單鏈接頭通用連接miRNA建庫(kù)方法的可靠性,適合用于微量循環(huán)miRNA的高通量測(cè)序。進(jìn)一步的,我們使用自有建庫(kù)方案,對(duì)血漿中游離miRNA和Exosome中miRNA進(jìn)行了文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析研究,結(jié)果顯示血清中游離的miRNA reads數(shù)和miRNA種類(lèi)都顯著少于Exosome,聚類(lèi)分析也顯示兩組樣本中大多數(shù)miRNAs沒(méi)有表達(dá)差異,但是Exosome中niRNA純度高,干擾背景小,是miRNA測(cè)序建庫(kù)的理想樣本。3.子癇病人及妊娠糖尿病人外周血循環(huán)miRNA表達(dá)譜的高通量測(cè)序分析妊娠是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程,miRNAs可能涉及了多種妊娠期疾病,比如子癇(PE)和妊娠糖尿病。我們使用高通量測(cè)序技術(shù),重點(diǎn)研究了子癇和妊娠糖尿病人外周血循環(huán)miRNA表達(dá)譜。針對(duì)先兆子癇孕婦與正常孕婦兩類(lèi)人群比較了胎盤(pán)、母體血清、臍帶血血清三類(lèi)樣本中miRNA表達(dá)譜的差異分析,胎盤(pán)樣本中發(fā)現(xiàn)11種與PE相關(guān)的miRNA;母體血清中發(fā)現(xiàn)22種與PE相關(guān)的miRNA;臍帶血血清中發(fā)現(xiàn)8種與PE相關(guān)的miRNA,且母血血清樣本中miRNA大部來(lái)自于人類(lèi)19號(hào)染色體中的19q13.42中。而后對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行生物信息分析,研究了其所參與的靶基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)這些miRNA均可能參與到了先兆子癇疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,外周血中的miRNA也具備早期診斷子癇疾病的潛力。由于Exosome中的miRNA比血清中游離的miRNA更加穩(wěn)定,因此我們利用高通量測(cè)序技術(shù)比較了妊娠糖尿病孕婦和健康孕婦血清Exosome中的miRNA的表達(dá)差異,為妊娠糖尿病的早期診斷提供可靠的分子標(biāo)記物。28個(gè)差異表達(dá)的]miRNA被挑選出來(lái),其中12個(gè)表達(dá)顯著上調(diào),16個(gè)表達(dá)明顯下調(diào),而后進(jìn)一步對(duì)5個(gè)在妊娠糖尿病混合血漿樣本中高豐度miRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)、功能分析和調(diào)控通路分析,篩選出5個(gè)基因和3個(gè)調(diào)控通路,這5個(gè)miRNA可能通過(guò)調(diào)控這5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,從而調(diào)控富集到的3個(gè)信號(hào)通路,導(dǎo)致妊娠糖尿病孕婦產(chǎn)生胰島素抵抗等一系列癥狀,這提供了一種妊娠糖尿病人胰島素抵抗的發(fā)病分子機(jī)制,也為妊娠糖尿病的早期診斷提供了潛在的分子標(biāo)記物。4.基于高通量測(cè)序的miRNA簇／家族、isomiRs的表達(dá)分析miRNA表達(dá)譜分析通常都集中在單個(gè)miRNA基因水平上。研究表明,miRNA易在染色體上簇生排列,并常常協(xié)同表達(dá),形成具有多樣性分布的miRNA簇；同時(shí)具有相近序列成分的miRNAs進(jìn)一步構(gòu)成相應(yīng)的miRNA基因家族。MiRNA前體序列可以形成多種在長(zhǎng)度、序列上存在差異性的miRNA異構(gòu)體(miRNA variants, isomiRs),而miRBase中注解的標(biāo)準(zhǔn)miRNA序列有時(shí)并不是isomiRs中表達(dá)豐度最高的形式�，F(xiàn)有常規(guī)miRNA分析流程往往不能對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘,基于miRNA基因簇和miRNA基因家族以及isomiRs的表達(dá)譜聯(lián)合分析,有利于進(jìn)行miRNA表達(dá)及功能研究,可以幫助理解miRNA精細(xì)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。我們首先研究了兩種同種異型細(xì)胞系(HEC-1B和ISK細(xì)胞系),作為數(shù)據(jù)分析策略的模型。單個(gè)miRNA水平上篩選出的差異表達(dá)的miRNA為105種。進(jìn)一步地,我們將差異表達(dá)的miRNAs依據(jù)來(lái)源和功能分成相應(yīng)的miRNA簇和家族,在ISK細(xì)胞系中有5個(gè)miRNA簇的整體表達(dá)相對(duì)于HEC-1B細(xì)胞系顯著上調(diào),有3個(gè)下調(diào)；同時(shí),5個(gè)miRNA家族總體表達(dá)相較HEC-1B顯著升高,2個(gè)顯著減少。我們挑選了9種表達(dá)最豐富的miRNA考察isomiR分布譜,發(fā)現(xiàn)同屬于mir-17簇的mir-17、 mir-18a、mir-19b的分布模式以及比例關(guān)系極為相近,而其他來(lái)源于不同簇的miRNA稍有差異。血漿]miRNA分類(lèi)后的差異性isomiR和miRNA簇／家族表達(dá)譜相比標(biāo)準(zhǔn)miRNA序列而言可能會(huì)是更為有效的標(biāo)志物。我們針對(duì)子癇病人的血漿miRNA進(jìn)行了表達(dá)譜聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)C19MC基因簇(尤其是miR-517b, miR-519d, miR-521,miR-515-3p)整體在子癇病人的血漿中相對(duì)于正常孕婦而言顯著升高,而其他基因簇則沒(méi)有表現(xiàn)出這種協(xié)同表達(dá)的模式。而且由C19MC編碼的miR-519d, miR-521和]miR-517b的isomiR表達(dá)譜極為相近,與之相比,非胎盤(pán)特異性的miRNAs(比如miR-451, miR-103和miR-145)isomiR類(lèi)型和數(shù)量在血漿和胎盤(pán)中顯然不同。
【圖文】：

即可用流式細(xì)胞儀分析鑒定ｅｘｏｓｏｍｅ表面的分子，還可經(jīng)固定后制逡逑成超薄切片用于電鏡觀察其形態(tài)。這種方法簡(jiǎn)便易行，只需較少的細(xì)胞，也可Ｗ逡逑在較短的時(shí)間內(nèi)就可Ｗ完成。分析結(jié)果不會(huì)受其它細(xì)胞蛋白和胎牛血清成分的干逡逑擾。逡逑１．４．邐４邋Ｅｘｏｓｏｍｅ的分子組成及其功能逡逑Ｅｘｏｓｏｍｅ獨(dú)特的蛋白組成取決于不同的細(xì)胞起源。Ｅｘｏｓｏｍｅ膜上分布有許多逡逑共刺激分子ＣＤ８６、ＣＤ８０和四跨膜區(qū)蛋白分子，如ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ８１、ＣＤ８２逡逑等，與上述的ＭＨＣ－ＩＩ復(fù)合物及共刺激分子協(xié)同發(fā)揮免疫刺激靴細(xì)胞的作用。而逡逑ｅｘｏｓｏｍｅ中選擇性富集的整合素、郭豁附素和ＣＤ分子等，貝ｉｊ介導(dǎo)ｅｘｏｓｏｍｅ對(duì)效逡逑應(yīng)細(xì)胞的{南蜆δ�，还緤J糯罅康南赴叢吹陌實(shí)鞍祝縋ち鞍�、小吭＠C義轄岷系鞍綴鴕恍┫赴羌芟喙氐鞍�，参与ｅｘｅP螅錚恚宓姆⑸緯�，与浆膜日娤衔嚫辶x習(xí)饈頭牛準(zhǔn)壩肫淥赴諍系墓獺ｅ義希恚椋遙危鈴鍚N過(guò)微粒（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）逡逑

邐６００邐１０００邐３０００邐１０３８０邋［ｂｐ］逡逑Ｂ逡逑圖２－３血漿ｅｘｏｓｏｍａｌＤＮＡ與血漿ＤＮＡ片段長(zhǎng)度分布的比較，Ａ為ｅｘｏｓｏｍａｌＤＮＡ的片段逡逑長(zhǎng)度分布：Ｂ為血漿ＤＮＡ的片段長(zhǎng)度分析。逡逑２３逡逑？．八ｉ邐－？邐－．１’．－＇．邋＇逡逑
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.2

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9 閆q，

本文編號(hào)：2537180