發(fā)布時(shí)間：2019-08-17 15:56

【摘要】：子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis, EMs）是一種復(fù)雜的婦科疾病，受遺傳、環(huán)境、免疫等相關(guān)因素影響，但至今病因未明，尋找致病基因是目前的研究熱點(diǎn)。全外顯子測(cè)序技術(shù)（Whole exome sequence, WES）是一種經(jīng)濟(jì)、有效的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)鑒定復(fù)雜疾病的致病基因有突破性發(fā)現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)應(yīng)用WES研究EMs的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用WES技術(shù)對(duì)在位、異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞進(jìn)行分析，嘗試尋找相關(guān)基因改變，期望可以在基因?qū)用嫔向?yàn)證病因假說(shuō)，有助于明確EMs的發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)部分。 一、激光捕獲顯微切割技術(shù)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥DNA提取及全基因組擴(kuò)增的方法學(xué)研究 目的：探索一套利用激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser capture microdissection,LCM）分離EMs腺體細(xì)胞提取微量DNA及全基因組擴(kuò)增（Whole genomeamplification, WGA）的操作流程。方法：利用LCM分別對(duì)10例石蠟標(biāo)本及10例冰凍標(biāo)本進(jìn)行腺體細(xì)胞捕獲，收集足量腺體細(xì)胞后提取微量DNA，，并對(duì)微量產(chǎn)物進(jìn)行濃度、吸光度檢測(cè)，經(jīng)多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。另利用LCM對(duì)5例石蠟標(biāo)本及5例冰凍標(biāo)本進(jìn)行捕獲，獲取細(xì)胞后行WGA，檢測(cè)產(chǎn)物濃度、吸光度。選取8個(gè)常見(jiàn)的人體管家基因片段進(jìn)行PCR以驗(yàn)證產(chǎn)物完整性，并對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果：冰凍與石蠟標(biāo)本在LCM獲取腺體細(xì)胞及提取微量DNA的環(huán)節(jié)中均可獲得滿意效果。但經(jīng)WGA后，石蠟標(biāo)本無(wú)法保留完整的基因組信息。結(jié)論：采用LCM對(duì)EMs冰凍切片進(jìn)行腺體細(xì)胞捕獲并提取微量DNA及WGA是一種操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定、可靠的方法，可作為日后EMs基因組研究常規(guī)技術(shù)路線之一。 二、全外顯子測(cè)序技術(shù)探尋卵巢子宮內(nèi)膜異位癥致病基因的研究 目的：采用WES技術(shù)對(duì)EMs在位、異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞DNA及外周血DNA進(jìn)行分析，尋找相關(guān)致病基因。方法：將7例LCM切割后在位、異位腺體細(xì)胞進(jìn)行WGA，并提取該7例患者例外周血DNA作為背景。合格標(biāo)本使用IlluminaHiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，得出原始數(shù)據(jù)，采用腫瘤分析流程進(jìn)行比對(duì)、過(guò)濾后對(duì)clean data進(jìn)行生物學(xué)信息分析。結(jié)果： MUC16、MGA、AHNAK、CENPE、HERC1、MAGEC1及PCLO7個(gè)基因可能參與卵巢內(nèi)異癥的發(fā)病，但確切結(jié)論需要后續(xù)大樣本量驗(yàn)證。結(jié)論：1.卵巢子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織腺體細(xì)胞基因改變明顯高于一般疾病，這可能是子宮內(nèi)膜的固有特性。2.卵巢子宮內(nèi)膜異位癥體細(xì)胞SNVs突變呈隨機(jī)化表現(xiàn)，不存在類(lèi)似腫瘤細(xì)胞的熱點(diǎn)突變。3.我們檢測(cè)出的致病基因參與細(xì)胞侵襲、黏附的過(guò)程，從側(cè)面支持了在位內(nèi)膜決定論。
【圖文】：

CM 細(xì)胞0 例冰凍切用 LCM 準(zhǔn)捕獲切片和 10 例準(zhǔn)確分離腺體結(jié)例石蠟切片體細(xì)胞（圖結(jié)果與分析片均可在顯微圖 1，2）。析微鏡下獲得得滿意的形態(tài)態(tài)學(xué)觀察定定位，

LLCM 細(xì)胞10 例冰凍切用 LCM 準(zhǔn)圖 1：捕獲切片和 10 例準(zhǔn)確分離腺體卵巢 EMs病A：石蠟例石蠟切片體細(xì)胞（圖病灶，可見(jiàn)組切片（HE，片均可在顯微圖 1，2）。組織中有異位200×）；B：微鏡下獲得位腺體結(jié)構(gòu)（：冰凍切片得滿意的形態(tài)（↑）及異�；℉E，200×態(tài)學(xué)觀察定基質(zhì)細(xì)胞。）定位，
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R711.71

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