【摘要】：研究背景與人體共生或寄生的不同類型微生物如細(xì)菌、病毒等被稱為人類的“第二基因組”,其廣泛分布于人體不同部位。分布平衡對(duì)人體健康有重要意義。部分常見性疾病如肥胖癥、糖尿病、哮喘、慢性非感染性腹瀉、炎癥性腸道病、腸易激綜合癥等目前認(rèn)為與細(xì)菌分布失衡存在相關(guān)性。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和深入,這些與人體健康密切相關(guān)的菌群的功能及其與臨床相關(guān)性將越來越多被認(rèn)知陰道定植著不同種屬和數(shù)量的微生物,共同維持正常的陰道微環(huán)境,對(duì)女性健康具有重要的作用。陰道微生物群落菌群紊亂可引起細(xì)菌性陰道病、霉菌性陰道炎等一系列感染性疾病,每年影響數(shù)以萬計(jì)的育齡期女性,并對(duì)其生活、社交、妊娠結(jié)局等均可產(chǎn)生影響。目前普遍認(rèn)為,乳酸桿菌為陰道的優(yōu)勢菌群,其通過空間占位,產(chǎn)生乳酸、H202、生物素以及營養(yǎng)競爭等方式抑制著陰道內(nèi)其它菌群的生長。與此同時(shí),可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等方法維持著陰道的酸性環(huán)境(pH值3.8-4.4)。此前對(duì)于微生物群落菌群主要是基于顯微鏡檢查和傳統(tǒng)培養(yǎng)法而獲得陰道菌群的相關(guān)信息。然而,由于陰道菌群數(shù)量巨大、種屬眾多,部分細(xì)菌很難通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)和分離鑒定的方法獲知。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)、分子遺傳學(xué)以及第二代高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展,使得進(jìn)一步認(rèn)識(shí)陰道微生物群落組成成為可能。既往研究已發(fā)現(xiàn),妊娠期由于多種激素分泌的改變,孕婦腸道菌群在不同孕周可發(fā)生較大改變。另外,晚孕期腸道菌群當(dāng)移植進(jìn)入無菌小鼠中,可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)孕晚期相關(guān)生理特征。陰道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜,并受到多種因素影響。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,陰道pH值、雌激素是維持陰道生態(tài)平衡和菌群結(jié)構(gòu)構(gòu)成的重要因素。妊娠期由于生理性的激素劇烈變化(體內(nèi)雌激素水平升高),使陰道內(nèi)糖原增加及堆積,有利于細(xì)菌的滋生和繁殖,容易發(fā)生陰道菌群紊亂；同時(shí)妊娠期陰道粘膜容易出現(xiàn)充血、水腫、細(xì)胞通透性增加,陰道粘膜屏障功能減退,加之妊娠期為了胎兒不被排斥而導(dǎo)致的部分免疫抑制,均是妊娠期容易出現(xiàn)陰道微生態(tài)菌群失衡的重要原因。陰道微生物群落菌群紊亂失衡與多種圍產(chǎn)期并發(fā)癥如絨毛膜羊膜炎、胎膜早破、早產(chǎn)、產(chǎn)褥期感染的發(fā)生密切相關(guān)。明確陰道微生物群落的組成與動(dòng)態(tài)變化有助于我們進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)該類疾病的發(fā)病機(jī)制以及制定相應(yīng)的防治措施。盡管目前已有研究對(duì)不同孕期陰道微生態(tài)菌群變化進(jìn)行相關(guān)的研究,但仍然存在以下問題：1)陰道不同部位采樣是否對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響；2)孕婦合并圍產(chǎn)期并發(fā)癥,如妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)時(shí),陰道菌群如何變化及其臨床意義仍無明確結(jié)論。研究目的1.孕期陰道不同部位的菌群特征差異分析2.不同孕周陰道菌群的特征分析；3.GDM孕婦陰道菌群結(jié)構(gòu)多樣性及與不良妊娠的關(guān)系。研究方法第一部分病例入組：隨機(jī)選擇就診本院產(chǎn)科門診的育齡期孕婦,年齡范圍20.1-38.2歲。樣本采集前30天內(nèi)未服用抗生素或抗真菌藥物,采集樣品前48小時(shí)內(nèi)無性生活,無陰道沖洗和／或局部用藥。共有34例孕婦入組。樣本采集：所有病例均由一位醫(yī)生負(fù)責(zé)完成檢查和樣本采集。婦產(chǎn)科醫(yī)生使用無菌窺陰器撐開陰道,用無菌陰道拭子分別于宮頸(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、陰道下1/3 (Vaginal canal, V)三個(gè)部位采集樣品。實(shí)驗(yàn)流程：提取細(xì)菌基因組總DNA,使用細(xì)菌16S通用引物,擴(kuò)增陰道拭子樣品的16S rRNA V46保守區(qū),將總PCR產(chǎn)物進(jìn)行PE 101-bp測序,并獲取分類操作單元(Operational-Taxonomic-Units, OTUs)。對(duì)其進(jìn)行分類；最后獲取樣品的α-多樣性、p-多樣性、同時(shí)根據(jù)UniFrac距離得到OTUs系統(tǒng)發(fā)育樹。尋找組與組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker,并進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。第二部分病例入組：選擇不同孕期的孕婦,分為孕中期(18.2±2.0w)和孕晚期(32.3±2.7w)與非孕期(NP)。第三部分研究對(duì)象：GDM組：在南方醫(yī)院婦產(chǎn)科門診首次進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)科檢查,年齡范圍19.4～39.2歲,平均28.5±3.7歲。孕16～20周,納入志愿者共340人。由婦科醫(yī)生行常規(guī)檢查,將無臨床其他癥狀或指證的陰道疾病的患者納入研究范圍。入組標(biāo)準(zhǔn)：①樣本采集前30天內(nèi)未服用抗生素或抗真菌藥物,采集樣品前48小時(shí)內(nèi)無性生活,無陰道沖洗和／或局部用藥；②本次妊娠前無高血壓、腎臟、心血管、肝臟、血液病等疾患者；③未曾服用過可能干擾糖、脂代謝藥物者(如消炎痛、酚妥拉明、速尿、噻唑類利尿劑、苯妥英鈉、可的松等)；④未合并內(nèi)分泌疾病(如甲亢、甲減、柯興氏綜合征)；⑤不吸煙、不飲酒者；⑥單胎妊娠、漢族。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血≥5.1 mmol/L,餐后1小時(shí)血糖≥10.0mmol/L,餐后2小時(shí)血糖≥8.5mmol/L。結(jié)果有1項(xiàng)或以上達(dá)到或超過正常值,即診斷為GDM。對(duì)照組：同期就診南方醫(yī)院產(chǎn)科門診產(chǎn)前檢查的孕產(chǎn)婦,排除GDM,其他入組條件均同GDM組。樣本采集：采集后穹窿的分泌物。實(shí)驗(yàn)流程：同第一部分和第二部分。研究結(jié)果第一部分1.1孕婦生殖道菌群總體結(jié)構(gòu)乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)是陰道菌群中最主要的組成成分,而阿托波菌屬,梭形桿菌屬,加德納菌屬,霍氏菌屬,普氏菌屬,鏈球菌屬所占的比例較小。在乳桿菌屬中,我們主要觀察到可以分為四亞類,分別是卷曲乳桿菌(L.crispatus),格氏乳桿菌(L.gasseri),惰性乳酸桿菌(L.iners)和詹氏乳桿菌(L.jessenii)。1.2孕婦生殖道三大采樣部位在“門”水平、“屬”水平菌群結(jié)構(gòu)無差異孕婦生殖道菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)組成。其中厚壁菌門比例達(dá)80%以上。三大采樣部位宮頸(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、陰道下1/3 (Vaginal canal, V)菌屬在“門”水平構(gòu)成無顯著差異。而“屬”水平的研究發(fā)現(xiàn),孕婦生殖道菌群主要由乳酸桿菌(Lactobacillus)組成,其比例達(dá)60%,其次是加德納菌(Gardnerella)、鏈球菌(Streptococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、普氏菌屬(Prevotella)等。但是,三大采樣部位宮頸(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、陰道下1/3 (Vaginal canal, V)菌屬在“屬”水平構(gòu)成無顯著差異。1.3孕婦生殖道三大采樣部位α-多樣性無差異生殖道菌群alpla-多樣性兩大指標(biāo)Shannon index和PD whole tree評(píng)估三個(gè)采樣部位的菌屬多樣性的差異。我們采用了K個(gè)對(duì)立樣品的秩和檢驗(yàn),結(jié)果顯示：無論是Shannon指數(shù)還是PD whole tree,三個(gè)部位alpha多樣性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第二部分2.1 不同孕周的生殖道菌群結(jié)構(gòu)特征及菌型(CST)分布情況女性生殖道菌群孕中期(18.2±2.Ow)和孕晚期(32.3±2.7w)與非孕期(NP)生殖道菌群結(jié)構(gòu)相似度高,主要以乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)為優(yōu)勢菌,比例達(dá)80%以上。孕早期(9.0±2.6w)和產(chǎn)后期(7.0±0.3w)生殖道菌群呈現(xiàn)特征性菌群結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為厭氧菌如：加德納菌(Gardnerella)、鏈球菌(Streptococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、普氏菌屬(Prevotella)、霍氏菌屬(Hallella)等比例增加。我們的數(shù)據(jù)可將陰道菌群分成四種菌型(Community state types, CSTs)。CSTI以卷曲乳桿菌(L.crispatus)為主導(dǎo),CSTⅡ以格氏乳桿菌(L.gasseri)為主導(dǎo),CSTⅢ則以惰性乳桿菌(Liners)為主要組成成分,CSTⅣ-A主要由少量的加德納菌(Gardnerella),奇異菌屬(Atopobium),鏈球菌屬(Streptococcus),普氏菌屬(Prevotella)和霍氏菌屬(Hallella).2.2不同孕周的生殖道菌群β多樣性我們通過加權(quán)的UniFrac距離(weighted UniFrac distance)展示了生殖道菌群β多樣性。NP期、T2期和T3期的樣品均緊緊聚集在一起,分布較集中,相似度高。而T1期分布較離散,其離散度較T2,T3更大,表明T1期菌群多樣性增加。而產(chǎn)后組的微生物菌群分布明顯不同于其他各組,離散度最大,體現(xiàn)產(chǎn)后期生殖道菌群的獨(dú)特性。2.3不同孕周的生殖道菌群α多樣性我們又進(jìn)一步分析了不同孕周的Shannon多樣性指數(shù),與其他四組(NP非孕組,T1孕早期,T2孕中期,T3孕晚期)相比,T1期和產(chǎn)后組(PP) Shannon多樣性指數(shù)顯著增高,尤以產(chǎn)后組最高。2.4不同孕周的生殖道菌群差異性菌屬不同孕周的生殖道菌群β多樣性和alpha多樣性均呈現(xiàn)顯著差異,我們使用LEfSe尋找各組間差異菌屬。T1組主要以鏈球菌(Streptococcaceae)豐富度增加,T3組發(fā)現(xiàn)紅蝽?xiàng)U菌(Coriobacteriaceae)和奇異菌(Atopobium)豐富度增加。NP未孕組主要以厚壁菌門(Firmicute)、乳酸桿菌(Lactobacillales)和桿菌(Bacilli)為主。而產(chǎn)后組(PP組)菌群特征主要是厭氧性菌屬的豐富度增加,主要包括擬桿菌門(Bacteroides),梭形桿菌(Fusobacterium),加德納菌(Gardnerella),霍氏菌屬(Hallella),未知菌屬(Incertae)和普氏菌屬(Prevotella)等。第三部分3.1 GDM陰道菌群heatmap聚類及陰道菌群特征我們將所有的樣品陰道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行heatmap(熱圖)聚類分析,用菌型(Community state type, CST)來描述陰道菌群結(jié)構(gòu)的分類。陰道菌群主要分為五大型(CSTⅠ-Ⅴ),其中有四型屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus spp.),它們分別是：(crispatus (CST Ⅰ,39.1%)、L.gasseri (CST Ⅱ,3.9%)、Liners (CST Ⅲ, 36.3%)和L.jensenii (CST V,4.5%)。CST Ⅳ又可以分為兩大亞類：CST Ⅳ-A (14.7%)和CST Ⅳ-B (1.5%)。CST Ⅳ-A的菌屬主要包括：Gardnerella(加德納菌屬)、Anaerococcus(氣球菌屬)、Corynebacterium(棒狀桿菌屬)、7inegoldia(達(dá)芬戈?duì)柕戮?、Streptococcus(鏈球菌)、Atopobium(奇異菌屬)、Prevotella(普氏菌屬)、Parvimonas(微單胞菌屬)、Sneathia(纖毛菌屬)、Mobiluncus(動(dòng)彎桿菌屬)和Peptoniphilus(吲哚嗜胨菌)。CST Ⅳ-B的特征是Atopobium(變異菌屬)占主要優(yōu)勢菌,同時(shí)伴有CST Ⅳ-A的多樣性菌屬。另外,我們發(fā)現(xiàn)GDM組并未呈現(xiàn)某種特征性菌型分布,而是散在分布,與非GDM組不能區(qū)分。我們對(duì)54例GDM患者的陰道菌群進(jìn)行了分類分析。在GDM患者中,13例是以惰性乳酸桿菌(L.iners)為優(yōu)勢菌,占31.5%,17例是以卷曲乳桿菌(L.crispatus)為優(yōu)勢菌,占23.5%,24例是以厭氧菌等多樣性菌共存的陰道菌群特征,占45.0%。GDM陰道菌群以厭氧菌等多樣性菌共存的比例上升。3.2 GDM陰道菌群alpha多樣性評(píng)估菌群alpha多樣性有四大指標(biāo),分別為：Shanon指數(shù)、PD whole tree、 Observed species、Chaol。結(jié)果顯示,GDM組與非GDM組在Shanon指數(shù)、PDwhole tree、Observed species、Chaol四大指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),說明了GDM陰道菌群菌屬的豐富度和和均度相似。3.3 GDM陰道菌群的影響因素我們采用Pearson距離和展示可能與GDM相關(guān)的因素。無論是菌型(CSTs)、孕周(Trimester)、pH、孕前BMI (Pre-BMI)都未能呈現(xiàn)特征性分布。結(jié)果表明,上述因素與GDM尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)。3.4 GDM陰道菌群與不良妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián)孕期陰道菌型(CSTs)與不良妊娠結(jié)局包括：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、分娩方式(Delivery mode)并未呈現(xiàn)特征性的陰道菌型聚集。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：胎膜早破、分娩方式、與菌型(CSTs)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(卡方檢驗(yàn),P0.05)。3.5 GDM特征性菌屬通過LEfSe統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌(Bifidobacteriaceae, Bifidobacteriaies)、放線菌(Actinobacteria)和毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)在GDM組豐富度增加。Non-GDM組主要是以假單胞菌(Pseudomonadales),變形菌門(Gammaproteobacteria)豐富度增加。研究結(jié)論1.不同部位采樣陰道菌群結(jié)構(gòu)無明顯差異；2.生殖道菌群在不同孕期呈現(xiàn)特征性變化。孕早期和產(chǎn)后期菌群結(jié)構(gòu)以厭氧菌為優(yōu)勢菌,且菌屬多樣性上升；3.GDM生殖道整體菌群結(jié)構(gòu)與非GDM無顯著差別,但厭氧菌比例及豐富度顯著升高：4.GDM與孕周、孕前BMI、陰道分泌物pH無關(guān)聯(lián)；5.GDM生殖道菌群與胎膜早破及剖宮產(chǎn)發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.259

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本文編號(hào)：2509792