【摘要】：目的:采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)對(duì)本院婦產(chǎn)科就診的因自然流產(chǎn)或死胎而終止妊娠的100例孕婦的絨毛及胎兒組織進(jìn)行13、16、18、21、22、X和Y染色體數(shù)目異常檢測,染色體探針包括為CSP18/CSPX/CSPY探針組,GLP13/GLPZI探針組,GLP16/GLP22探針組,探討自然流產(chǎn)或死胎組織染色體數(shù)目異常的發(fā)生率及異常發(fā)生種類;比較各懷孕時(shí)間段(妊娠早期、中期、晚期)的染色體異常發(fā)生結(jié)果;探討年齡、自然流產(chǎn)史與染色體數(shù)目異常發(fā)生率關(guān)系。本研究對(duì)于明確自然流產(chǎn)或死胎死產(chǎn)原因具有重要的臨床意義,并為指導(dǎo)下一胎妊娠提供遺傳資料。方法:1 B超診斷自然流產(chǎn)或死胎的發(fā)生研究對(duì)象主要癥狀有停經(jīng)后陰道流血,下腹隱痛,子宮及附件區(qū)壓痛,宮頸舉痛等。采用GE-E8型彩色多普勒型超聲診斷儀探測子宮輪廓、大小、盆腔、宮腔內(nèi)及附件區(qū)等情況,根據(jù)妊娠囊著床部位、形態(tài)大小、胎芽胎心搏動(dòng)或胎兒大小、胎盤及羊水情況等,判斷是否為異常妊娠或死胎。2人工流產(chǎn)術(shù)、鉗刮術(shù)、死胎引產(chǎn)術(shù)人工流產(chǎn)術(shù):采用芬太尼聯(lián)合丙泊酚靜脈麻醉,術(shù)中予常規(guī)供氧并監(jiān)測心律呼吸、血壓和血氧飽和度。通過顯示屏觀察并引導(dǎo)吸引管方向及深度,待吸刮出孕囊及附屬物后,檢查吸出物可見絨毛組織。鉗刮術(shù):手術(shù)麻醉、術(shù)時(shí)監(jiān)測同人工流產(chǎn)術(shù)�；颊咝g(shù)前3小時(shí)陰道放置或口服米索前列醇200μg。在超聲引導(dǎo)下卵圓鉗進(jìn)入宮腔后,夾住妊娠組織,向外牽拉。術(shù)者通過顯示屏觀察并引導(dǎo)手術(shù)器械方向及深度,觀察手術(shù)全過程,可將妊娠組織物清除。死胎引產(chǎn)術(shù):a.利凡諾羊膜腔內(nèi)注射法:患者取仰臥位,先用B超定位穿刺點(diǎn),用腰穿針從穿刺點(diǎn)垂直進(jìn)針,進(jìn)入羊膜腔內(nèi)。將利凡諾50~100mg注入羊膜腔內(nèi)。b.米索前列醇引產(chǎn)術(shù):米索前列醇25~50μg放入陰道后穹隆,根據(jù)宮縮情況每3~4小時(shí)重復(fù)一次,24小時(shí)總量不超過150μg。觀察產(chǎn)程,產(chǎn)后仔細(xì)檢查胎盤、臍帶、胎兒。3標(biāo)本取材處理早期自然流產(chǎn)選擇絨毛作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本,死胎病例選擇肌肉等組織作為標(biāo)本。無菌條件下,用小剪刀去掉蛻膜組織,取實(shí)驗(yàn)組織大小約0.5 cm×0.5 cm,約20~25 mg,盡可能剪碎,注意盡量避免母體細(xì)胞污染。將新鮮標(biāo)本用生理鹽水洗凈,4℃保存不超過四天,處理至固定液的標(biāo)本-20℃保存不超一個(gè)月。4玻片制備將約5 mg已處理好的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本,加入0.075M KCL溶液5 ml(KCL溶液已預(yù)熱至37℃),37℃條件下低滲15 min,期間輕輕吹打細(xì)胞懸浮2次,后離心吸棄上清;沿壁緩慢加2.5 ml固定液(冰乙酸:甲醇=1:3),緩慢吹打懸浮細(xì)胞,后離心吸棄上清;加入固定液5 ml先后進(jìn)行兩次固定,離心吸棄上清;加入冰醋酸1 ml進(jìn)行消化2min,隨即加入甲醇4 ml進(jìn)行消化終止,后離心吸棄上清;最后根據(jù)管底的細(xì)胞量多少加入適量的固定液,輕輕吹打懸浮細(xì)胞,后每個(gè)標(biāo)本滴3張玻片,供FISH雜交備用。5 FISH檢測FISH探針購自北京金菩嘉公司,按熒光原位雜交試劑盒提供的說明書操作,將制備好的玻片先后進(jìn)行2×SSC(p H7.0)溶液漂洗、0.08 mg/ml胃蛋白酶消化、乙醇脫水干燥、75℃變性,42℃雜交16 h,洗片,采用DAPI復(fù)染,后在Olympus BX5型熒光顯微鏡下觀察,圖像由JENOPTIK(Prog Res MFcool)冷CCD采集,采用Video Test-FISH2.0軟件分析雜交信號(hào)。6結(jié)果判讀GLP13/GLP21探針組經(jīng)FISH檢測在正常細(xì)胞核中顯示信號(hào)為2紅,2綠;CSP18/CSPX/CSPY探針組則顯示2藍(lán)、1綠、1紅(男性),或2天藍(lán)、2綠(女性);GLP16/GLP22探針組顯示2綠和2紅。每組探針需要計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞,單獨(dú)判斷每種染色體異常與否的指標(biāo),若正常指標(biāo)的比例90%,異常比例10%,則該指標(biāo)無異常;若某指標(biāo)的異常比例60%,則提示該指標(biāo)異常;若某指標(biāo)的異常細(xì)胞比例介于10%~60%間,則提示為嵌合體,應(yīng)再計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞,計(jì)算異常比例。7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±?)表示,組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn),以P0.05表示結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1病例診斷及調(diào)查結(jié)果獲得100例病例組織,均為單胎,宮內(nèi)妊娠。其中絨毛標(biāo)本96例,肌肉標(biāo)本4例,平均年齡28.24±5.24歲,平均孕周11.24±4.06,平均既往自然流產(chǎn)次數(shù)1.74±0.96。2 FISH檢測染色體異常病例對(duì)100例自然流產(chǎn)(其中不全流產(chǎn)者21例,均12周)及死胎組織中13、16、18、21、22、X及Y染色體的異常情況進(jìn)行FISH檢測分析,檢測成功率為100%,包括陽性結(jié)果45例,異常率為45%,陰性結(jié)果為55例。3 FISH檢測染色體異常類型染色體異常的45個(gè)病例中,主要包括16三體(9例,20.00%),XO(8例,17.78%),三倍體XXY(8例,17.78%),22三體(4例,8.89%)和13三體(4例,8.89%)。4各妊娠時(shí)間段自然流產(chǎn)的染色體異常結(jié)果按照孕婦流產(chǎn)及死胎引產(chǎn)時(shí)的懷孕時(shí)間不同,將100例病例分為三組進(jìn)行檢測,68例為早期妊娠,22例為中期妊娠和10例晚期妊娠,三組染色體的數(shù)目異常發(fā)生率分別為60%、35.55%和4.44%,三組間染色體異常發(fā)生率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5自然流產(chǎn)史與染色體異常發(fā)生率的關(guān)系根據(jù)孕婦既往自然流產(chǎn)次數(shù)的不同,將100例病例分為3組,58例無自然流產(chǎn)史者,21例1次自然流產(chǎn)者,≥2次自然流產(chǎn)者為21例,三組染色體異常病例人數(shù)分別為23、11和11,染色體的數(shù)目異常率分別為39.65%、52.38%和52.38%,三組間染色體的異常發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6年齡與染色體數(shù)目異常發(fā)生率關(guān)系按照孕婦年齡將100例病例分為2組,14例年齡≥35歲,86例年齡35歲,兩組染色體異常病例人數(shù)分別為10和35,染色體異常率分別為71.43%和40.70%,兩組間染色體異常率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1 FISH檢測100例樣本全部成功,檢出染色體數(shù)目異常病例45例,異常率45%,異常類型主要為16三體(20.00%),XO(17.78%)和XXY(17.78%)。2孕婦早、中、晚期妊娠三階段自然流產(chǎn)及死胎的發(fā)生率分別為60%、35.55%和4.44%,組間的染色體異常率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但提示流產(chǎn)孕周越早,胚胎染色體的異常發(fā)生率就會(huì)越高。3孕婦既往不同自然流產(chǎn)次數(shù)(0次、1次和≥2次)組間染色體異常發(fā)生率的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4孕婦不同年齡組間(35歲和≥35歲)染色體異常發(fā)生率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的重要因素,FISH技術(shù)是一種快速準(zhǔn)確的分子診斷技術(shù),對(duì)于明確自然流產(chǎn)原因具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2498624